【摘 要】
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目的:新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2）的入侵始于刺突（spike,S）蛋白与病毒受体结合,而血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）在此过程中起到重要的作用,因为它是SARS-CoV-2入侵宿主细胞的关键受体。目前除了疫苗开发,阻断ACE2来抑制
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目的:新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2）的入侵始于刺突（spike,S）蛋白与病毒受体结合,而血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）在此过程中起到重要的作用,因为它是SARS-CoV-2入侵宿主细胞的关键受体。目前除了疫苗开发,阻断ACE2来抑制病毒入侵已成为防治的另一关注点。外泌体（exosome）是一种潜在的多功能治疗工具,本课题利用基因工程技术,成功构建工程化ACE2+-exosome,探究其是否会像诱饵一样,可以与宿主细胞竞争性地与SARS-CoV-2结合,防止病毒的初始感染或进一步传播,减轻由新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）所引起的肺部损伤,为SARS-CoV-2的防护以及COVID-19的治疗提供一种新策略。方法:为了获得ACE2+-exosome,我们用表达ACE2的DNA载体转染HEK293T细胞,纯化处理后获得稳定表达ACE2的HEK 293T-ACE2细胞株。收集细胞上清,采用超速梯度离心分离外泌体,对所获得外泌体进行Western blot,细胞流式仪等检测ACE2表达。为了构建SARS-CoV-2假病毒,我们将SARS-CoV-2的S蛋白全基因克隆在小鼠白血病病毒（murine leukemia virus,MLV）包膜载体（envelope vector）上,置于CMV启动子下,然后与含有荧光素酶报告基因（luciferase）的MLV骨架载体及其结构蛋白（gag/pol）载体共转染HEK293T细胞,制备SARS-CoV-2假病毒。最后我们设计了四种不同的实验条件来检测ACE2+-exosome对SARS-CoV-2假病毒的阻断作用。实验条件一:将SARS-CoV-2假病毒与三种不同的外泌体同时加入靶细胞内,37°C孵育48h后检测荧光值,计算抑制率,并对靶细胞荧光素酶表达量进行Western blot检测。实验条件二:将SARS-CoV-2假病毒与三种不同的外泌体37°C孵育30分钟后加入靶细胞,48h后检测荧光值,计算抑制率,并对靶细胞荧光素酶表达量进行Western blot检测。实验条件三:将三种不同的外泌体加入靶细胞4℃孵育,此时病毒仅仅是吸附到靶细胞表面而不会进入细胞,30分钟后加入SARS-CoV-2假病毒,48h后检测荧光值,计算抑制率,并对靶细胞荧光素酶蛋白表达进行Western blot检测。实验条件四:将三种不同的外泌体加入靶细胞37°C孵育30分钟后加入SARS-CoV-2假病毒,48h后检测荧光值,计算抑制率,并对靶细胞荧光素酶表达量进行Western blot检测。结果:对所获得外泌体检测,发现外泌体的活性和纯度较高,稳定表达ACE2且具有良好的生物相容性。通过三质粒共转染成功制备出了SARS-CoV-2假病毒。它们进入细胞的方式与天然病毒类似,但不含有病毒基因组,具有较高的实验安全性和可操作性。在体外实验中,我们发现与其他对照组相比,ACE2+-exosome对SARS-CoV-2假病毒入侵靶细胞具有较好的阻断作用。结论:工程化ACE2+-exosome能够像诱饵一样,与宿主细胞竞争性的与SARS-CoV-2假病毒结合,进而在一定程度上阻止SARS-CoV-2对宿主细胞的感染,为SARS-CoV-2的防护以及COVID-19的治疗提供一种新策略。
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