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目的糖尿病及其并发症作为一类常见的慢性疾病,给患者个人以及社会带来了巨大的负担。糖尿病发病机制众多,其中胰岛素抵抗、胰岛β细胞的损伤及功能障碍被认为在糖尿病发病过程中起重要作用,而全身慢性炎症则被认为是导致胰岛抵抗和胰岛素分泌绝对/相对不足一个重要因素。作为天然免疫系统的重要受体,Toll样受体家族(Toll like receptors,TLRs)在诱导机体炎症因子的释放、促进相关疾病的发生中起着重要的作用。另外,作为在胰腺中表达较高的受体,TLR3相关信号通路在调节免疫炎症和葡萄糖稳态过程中起重要调节作用,但具体作用机制尚不明确。本研究选用小鼠胰岛β细胞株(NIT-1)为研究对象,用TLR3的特异性激动剂聚肌胞Poly(I:C)(PIC)刺激小鼠的胰岛β细胞。旨在探讨激活TLR3信号通路对胰岛β细胞增殖和凋亡的影响与可能的作用机制。方法采用NIT-1细胞株为研究对象,用DMEM培养基培养细胞,定期更换细胞培养液。根据细胞生长情况进行传代培养,当细胞处于增殖期比例达到80%-90%时进行实验分组。分为空白对照组及实验组,分别接种在96孔板上进行培养。24小时候后观察各组细胞贴壁和生长情况,然后分别予以实验组NIT-1细胞不同质量浓度的PIC(30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml)刺激,干预48小时后检测以下指标:1、流式细胞计数检测细胞增殖情况;2、实时荧光定量PCR定量检测各组Toll/IL-1受体接头蛋白分子(Toll/IL-1receptor domain containing adaptor protein inducing IFN-β,TRIF)和核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)m RNA表达情况;3、免疫印迹法检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、凋亡蛋白Caspase-3、TRIF以及NF-κB蛋白表达。结果1、通过流式细胞计数方法检测细胞增殖的情况。与空白对照组相比,随着PIC刺激浓度的增加,NIT-1细胞停留在G0/G1期细胞的比例明显上调(P<0.0001),而在S期和G2/M期的细胞比例出现明显下调(P<0.0001)。2、与空白对照组比较,胰岛β细胞TRIF和NF-κB的m RNA表达量随着PIC刺激浓度的升高而上调。在低浓度PIC(30μg/ml)刺激时,m RNA表达出现了上升趋势,但结果无统计学差异(P>0.05),而在中等浓度和高浓度时m RNA表达量明显上调(P<0.01)。3、通过对比不同浓度PIC刺激下的蛋白印迹条带CCND1灰度值与GAPDH灰度值发现,与对照组比较,细胞周期蛋白CCND1表达量在不同浓度PIC刺激下均明显下调(P<0.0001),且与PIC刺激浓度的升高呈现负相关,在90μg/ml时下调程度最大(P<0.0001)。4、在予以不同浓度PIC处理后,凋亡相关蛋白分子caspase3的表达出现了明显改变。pro-CASP3在低浓度和中浓度PIC刺激时表达量较空白对照组有差异(P<0.05),但是其上调程度明显低于高浓度刺激(P<0.0001);各干预组细胞经PIC刺激后,cleaved-CASP3蛋白表达量较空白对照组也明显升高,且升高幅度呈浓度依赖性(P<0.0001)。5、相比于空白对照组,NIT-1细胞在经不同浓度PIC干预后,TRIF蛋白表达均呈现明显上调(P<0.0001)。在60μg/ml和90μg/ml浓度下刺激时,TRIF蛋白上升程度较低浓度(30μg/ml)刺激时有明显差异(P<0.0001),且呈现出浓度依赖的趋势。6、相比于空白对照组,在经不同浓度PIC干预后,NIT-1细胞NF-κB蛋白表达均出现明显上调,且呈现浓度依赖性上升(P<0.0001)。高浓度PIC(90μg/ml)刺激下,NF-κB的表达明显高于对照组,且高于低浓度与中浓度刺激组(P<0.0001)。结论1.TLR3的激活可能通过TRIF-NF-κB信号通路诱导胰岛β细胞细胞周期蛋白cyclin D1表达下调,进而抑制了胰岛β细胞的增殖,使其增殖停留在G0-G1期;2.TLR3信号通路的激活,诱导细胞凋亡的重要蛋白caspase3表达上调,提示其参与了胰岛β细胞的细胞凋亡;3.TLR3-TRIF-NF-κB炎症信号通路对胰岛β细胞增殖和凋亡的调节作用,为糖尿病的治疗提供了新的理论依据。