研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,外科手术是最有效的治疗方法,但超过80%的患者诊断时已失去了手术机会。全身性化疗是晚期肝癌患者的主要治疗方法,但不论是单药还是多药联合治疗效果均不理想。因此,如何提高HCC治疗效果是肿瘤学界研究的热点。肿瘤微环境(tumor microenviroment)通常是由肿瘤细胞、间质细胞、微血管、组织液及一些浸润的免疫细胞(如树突状细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞等)组成,其与肿瘤的发生、发展和转移有着密切联系。在肝癌的发生、发展过程中,由于肿瘤血管的“畸形”生长以及肿瘤细胞的快速增殖必然导致肿瘤细胞长期处于缺血、缺氧和低p H的肿瘤微环境中,而这些因素均可诱导微环境中的肿瘤细胞发生内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)以应对恶劣的生存条件,维持自身生存。4巨噬细胞是一种可塑性很强的细胞,在维持机体内环境稳态,调控新生血管形成等方面具有重要作用。多项研究表明,巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要组成部分,且肿瘤微环境中的巨噬细胞在多种因素的作用下常常发生表型变化转变为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM),进而发挥促进肿瘤增殖、侵袭迁移等有利于肿瘤进展的作用。然而,肿瘤细胞通过何种途径使原本具有抗肿瘤的巨噬细胞转变为促进肿瘤发展的巨噬细胞尚不清楚。Exosome是一类直径大约为40-100nm的圆形或类圆形囊泡样结构,近年研究发现其在细胞间信号传递中发挥重要作用。因此,深入研究微环境中的肿瘤细胞如何将应激信号传递给与巨噬细胞,进而改变其免疫功能具有重要的临床意义。本课题拟探讨内质网应激的肝癌细胞能否影响巨噬细胞的免疫功能及可能的分子机制。目的通过将处于ERS状态与未ERS的肝癌细胞释放的exosome与巨噬细胞共培养,观察巨噬细胞PD-L1及炎症因子的表达状况,了解内质网应激的肝癌细胞对巨噬细胞免疫功能的影响。并通过高通量测序探讨ERS是否影响肝癌细胞exosomal-mi RNAs的分泌,进一步研究肝癌细胞ERS相关exosome调控巨噬细胞PD-L1表达的具体机制。方法(1)分别使用不同浓度的TM作用肝癌细胞24小时和同一浓度TM作用肝癌细胞不同时间,采用Western-Blot方法检测内质网应激标志蛋白GRP78的变化。(2)使用3μM的TM与肝癌细胞共培养24小时,分别收集TM处理组(Exo-TM)和未处理组细胞(Exo-con)的上清液,使用Exo Quick-TC试剂盒提取exosome,透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察exosome的形态、大小,Western-Blot方法检测exosomes标志蛋白CD63、TSG101以及分子伴侣蛋白Calnexin的表达。(3)使用膜染料PKH67标记exosome,然后将PKH67标记的exosomes与巨噬细胞共同孵育或尾静脉注射到裸鼠体内,12h后共聚焦显微镜观察巨噬细胞吞噬exosome的情况。(4)将不同的exosome(Exo-con和Exo-TM)与THP-1巨噬细胞(经100ng/ml PMA诱导48小时所得)共培养24小时,分别收集细胞和上清液,使用流式细胞仪检测PD-L1表达,CBA细胞因子试剂盒检测炎症因子表达。(5)将不同exosome(Exo-con和Exo-TM)与THP-1巨噬细胞共培养24小时,收集细胞,提取总RNA,进行Affymetrix m RNA表达谱芯片检测,以了解PD-L1和炎症因子等m RNA水平表达变化。(6)分别对裸鼠尾静脉注射100μl的PBS、Exo-con和Exo-TM,隔日一次,共10次。注射结束后24h,处死裸鼠收集腹腔巨噬细胞,贴壁2小时后换液弃去未贴壁细胞,剩余细胞培养过夜后收集细胞和上清液,流式细胞仪检测PD-L1和炎症因子的表达。(7)高通量测序检测ERS和未ERS的Hep G2细胞来源的exosomes中mi RNAs的表达差异,KEGG、GO分析与巨噬细胞免疫功能相关的mi RNAs及通路变化。(8)分别收集Exo-con和Exo-TM与THP-1巨噬细胞共培养24小时后的细胞,提取总蛋白,Western-Blot方法检测PTEN、AKT和p-AKT等蛋白水平变化。(9)使用si RNA干扰THP-1巨噬细胞PTEN表达,Western-Blot方法检测PTEN-PI3K-AKT通路蛋白变化,流式细胞术检测干扰后THP-1巨噬细胞PD-L1表达变化。(10)使用mi RNA-23a-3p的mimics、inhibitor以及各自的对照转染THP-1巨噬细胞后,Western-Blot方法检测PTEN、AKT和p-AKT等蛋白水平变化,流式细胞术检测THP-1巨噬细胞PD-L1表达变化。结果(1)TM可浓度依赖性地上调肝癌细胞GRP78表达,但当TM浓度达到3μM时,增加TM浓度仅轻微增加GRP78蛋白表达;3μM浓度的TM与肝癌细胞共培养,随着作用时间的延长GRP78表达增加,但24小时与48小时结果无差异(P=0.671)。(2)透射电镜可见收集到的“exosome”呈圆形或类圆形膜性囊泡样结构,直径为40-100nm,符合exosome的典型特征。Western-Blot检测显示所得的“exosome”表达CD63和TSG101,但不表达内质网分子伴侣蛋白Calnexin,进一步证明上清中收集到的是不含细胞成分的exosome。BCA蛋白定量法对所得exosome总蛋白进行定量,结果表明TM作用24h后肝癌细胞分泌的exosomes明显增加(P<0.01)。(3)激光共聚焦显微镜显示,PKH67标记的exosomes能够被THP-1巨噬细胞和腹腔巨噬细胞所摄取,流式细胞术结果进一步证明腹腔巨噬细胞能够摄取PKH67标记的exosome。(4)Affymetrix m RNA表达谱芯片检测结果显示,与对照组和Exo-con组相比Exo-TM可明显上调PD-L1和多种炎症因子(如IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-10和TNF-α等)的m RNA表达水平。(5)流式细胞术和免疫组化结果均显示,与对照组和Exo-con组相比Exo-TM可明显上调THP-1巨噬细胞PD-L1。CBA炎症因子检测结果显示,Exo-con和Exo-TM均可上调IL-1β,IL-6,IL-10和TNF-α等炎症因子的表达,且exo-TM的作用更明显。类似的,将Exo-con和Exo-TM通过尾静脉注射到裸鼠体内,Exo-TM注射小鼠的腹腔巨噬细胞PD-L1表达也明显上升,且细胞上清中的IL-6,IL-10和TNF-α等炎症因子的表达明显升高。(6)对Exo-con和Exo-TM进行mi RNAs高通量测序,结果显示共有112个差异表达的mi RNAs,其中14个mi RNAs的表达存在显著差异性。相对于Exo-con组,Exo-TM组中有8个mi RNAs显著上调,6个mi RNAs显著下调。q RT-PCR验证结果显示mi R-23a-3p和mi R-29a-3p在Exo-TM组分别上调了2.44倍和1.95倍,而mi R-486-3p和mi R-486-5p在Exo-TM组分别下调了0.87倍和1.96倍。经生物信息学分析软件预测发现在PTEN可能是mi R-23a-3p的靶基因之一,它可能通过调控PI3K-AKT通路发挥作用。(7)Western-Blot检测显示Exo-TM与THP-1巨噬细胞共培养24小时后能显著下调PTEN蛋白水平并升高p-AKT水平。转染PTEN特异性si RNA干扰PTEN表达可明显上调巨噬细胞PD-L1的表达。(8)转染mi R-23a-3p mimics使THP-1巨噬细胞PTEN蛋白明显下调,p AKT蛋白水平明显上调。与此相反,转染mi R-23a-3p inhibitor上调THP-1巨噬细胞PTEN蛋白,同时下调p AKT蛋白水平。流式细胞术检测结果显示,转染mi R-23a-3p mimics能够明显升高THP-1巨噬细胞的PD-L1表达水平。结论(1)内质网应激影响肝癌细胞exosome的分泌。(2)内质网应激的肝癌细胞释放的exosome能够被巨噬细胞吞噬摄取,并通过上调PD-L1和炎症因子表达等方式影响其免疫功能。(3)内质网应激的肝癌细胞释放的exosome通过传递mi RNA-23a-3p抑制PTEN表达,从而激活PI3K-AKT-PD-L1通路上调巨噬细胞PD-L1表达。