乙肝病毒(hepatitis b virus,HBV)为嗜肝病毒,全世界有超过3亿人受到乙肝病毒的感染,患上慢性肝炎,进而发展成肝硬化,甚至肝癌.乙肝病毒感染已成为排名第九的世界范围内最常见致死病因.对HBV最新的研究为预防和治疗乙肝起到了巨大的推动作用,特别是乙肝病毒疫苗的出现.乙肝病毒包括S、P、C和X四段基因,其中S基因编码的表面抗原HBsAg具有抗原性,已被作乙肝病毒疫苗.目前接种乙肝疫苗后,约有5~10﹪的人无应答或低应答.乙肝preS基因编码产物也具有很强的抗原性,可以帮助机体克服对HBsAg的无应答,故可用preS/S基因进行表达,制备新的乙肝疫苗,增强免疫效果,提高覆盖率.该研究利用基因重组技术,将HBV preS/S基因通过酵母附加型载体在酿酒酵母中表达,构建了胞内表达HBV preS/S蛋白的基因工程菌.首先设计引物利用PCR技术,以HBV病毒DNA为模板体扩增出HBV preS/S基因.然后就将PCR扩增得到的目的片段连接T载体进行测序.将测序结果进行序列分析,与GeneBank中的HBV preS/S基因序列进行比较,分析同源性,并确定该基因片段编码蛋白的血清型.选择带有标记的表达载体,将目的基因插入表达载体的多克隆位点,使其融合于载体中抗原表位标记FLAG的下游,可用于目的基因产物的分离和纯化.经过限制性酶切鉴定后,构建得到重组酵母表达载体.将重组表达载体pESC-preS/S用LiAc法转化酿酒酵母YPH50,重组载体质粒利用2μ复制子在酵母中自主复制.在尿嘧啶营养缺陷型平板SD上筛选阳性重组转化子,通过菌落PCR法进行初步鉴定.然后将初步筛选出来的重组子通过提取酵母质粒并酶切的方法进行鉴定.最终筛选得到含有重组质粒pESC-preS/S的酵母转化子.根据宿主菌和重组菌在不同生长时期培养液中细胞密度绘制它们生长曲线图,分析两者生长规律,结果表明两者并无太大差别.说明外源基因的导入到宿主酵母的生长无明显干扰.将重组菌液体培养并诱导表达外源蛋白,经诱导16小时后离心收集菌体,玻珠法破壁提取蛋白,浓缩后进行SDS-PAGE分析,经Western blot分析鉴定,结果表明重组菌培养液能够表达HBV preS/S蛋白.