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急性缺血性卒中后功能障碍给社会经济造成了严重负担。及时开通闭塞的血管是有效的治疗方法。然而即使经过严格筛选,仅12~34%的患者可但复流脑组织的进行性损伤却是大量患者存在持续的神经功能缺损。随着早期再通治疗的逐步推广,根据疾病发展规律有针对性地寻找减轻再通治疗后脑组织缺血/再灌注损伤的方法是进一步降低缺血性卒中相关残障的重要任务。血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)普遍存在于机体组织,是介导氧化应激、促进炎症反应的重要物质。AngⅡ高表达小鼠脑缺血/再灌注损伤程度更为严重;阻断血管紧张素1型受体可减轻脑缺血/再灌注损伤。这些证据均表明血管紧张素系统可能在脑梗死病理生理过程中具有重要作用。近年来发现的血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme 2,ACE2)可将AngⅡ转化为在功能上与之拮抗的血管紧张素1-7(Ang(1-7)),被认为对缺血性卒中具有保护作用。地米那嗪(Diminazene aceturate,DIZE)是一种潜在的ACE2激动剂。有研究发现,在内皮素诱导一过性局灶性脑缺血(transient focal ischemia)后对大鼠腹腔注射DIZE可显著缩小脑梗死体积并改善神经功能,但机制不详。由于这种给药途径和给药时间具有极高的临床转化价值,本研究目的在于利用更符合临床大动脉急性闭塞再通的线栓模型验证腹腔注射DIZE对不同类型脑缺血/再灌注早期损伤的保护作用,并初步探索可能的机制,为进一步明确其最佳适应证奠定基础。第一部分大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型的建立与评价目的:通过腔内线栓法构建大鼠局灶性缺血/再灌注损伤模型,探索缺血时间与再灌注脑损伤程度及主要方式的关系。方法:1、缺血时间与再灌注脑组织损伤程度的关系将32只实验大鼠随机分为两组,分别建立大脑中动脉一过性闭塞1小时或2小时模型,于再灌注后24小时观察神经功能并取材检测如下指标:(1)建模成功大鼠24小时内死亡率(n=16/组);(2)大鼠神经功能损伤程度评分(NSS)(n=16/组);(3)通过ttc染色评价两组梗死体积的差异(n=10/组);(4)通过he染色及tunnel染色反映脑组织病理特征(n=6/组);2、不同缺血时间下再灌注脑组织mda水平变化趋势将24只实验大鼠随机分为四组,同样建立大脑中动脉短暂闭塞1小时或2小时模型,两组分别于再灌注后6小时或24小时处死并取脑检测缺血区域mda含量;另设立空白组(6只)作为mda基线水平。结果:1、缺血时间与再灌注脑组织损伤程度的关系(1)实际使用大鼠68只(7只造模失败),缺血1小时组24小时内无死亡,缺血2小时组中5只于24小时内死亡,死亡率17.8%;(2)缺血1小时组nss评分显著低于缺血2小时组(4.0[3.5,5.0]v.s.10.5[8.5,11.5],p<0.001);(3)ttc显示缺血1小时及2小时组梗死体积百分比分别为11.0±5.2,13.4±3.8,两组间无统计学意义;(4)缺血2小时组tunel阳性细胞比例高于缺血1小时组;2、不同缺血时间下再灌注脑组织mda水平变化趋势缺血1小时组24小时缺血区域皮层mda水平显著高于6小时;缺血2小时组24小时mda水平较6小时降低。结论:在本研究条件下,一过性缺血1小时/2小时模型中氧化应激损伤发展速度存在显著差异,缺血1小时再灌注后脂质氧化程度高峰出现于再灌注第6小时后。第二部分腹腔注射dize对大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响目的:采用不同缺血时间的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,评价腹腔注射dize对再灌注脑组织损伤的影响。方法:1、腹腔注射dize对缺血1小时再灌注损伤的影响将成年雄性sd大鼠随机分为5组:a、假手术(颈动脉分叉部分离);b、缺血1小时+腹腔注射生理盐水;c、缺血1小时+腹腔注射生理dize1.0mg/kg;d、缺血1小时+腹腔注射生理dize5.0mg/kg;e、缺血1小时+腹腔注射生理dize15.0mg/kg。以术后24小时为研究终点,通过nss评分评估五组神经功能缺损情况;通过ttc染色评价后四组梗死范围(%)(n=10)。进一步以保护效应最显著的最低剂量作为实验剂量,以假手术组及生理盐水为阴性对照及阳性对照;通过tunel染色检测缺血脑组织中不可逆损害细胞比例(n=6/组);通过生化试剂盒检测梗死周围组织丙二醛(mda)浓度反映氧化应激水平(n=6/组);westernblot检测caspase3活化水平(n=6/组)。2、腹腔注射dize对缺血2小时再灌注损伤的影响将成年雄性sd大鼠随机分为3组:a、假手术(颈动脉分叉部分离);b、缺血1小时+腹腔注射生理盐水;c、缺血1小时+腹腔注射生理dize5.0mg/kg。以术后24小时为研究终点,通过nss评分评估三组神经功能缺损程度;通过ttc染色评价后两组梗死范围(%);通过检测缺血脑组织mda水平反映脂质氧化程度。3、腹腔注射dize对ace2活性、angⅡ及ang(1-7)水平的影响取空白组、缺血1小时再灌注第24小时大鼠血浆及脑组织,通过elisa检测脑组织及血浆ace2活性、angⅡ及ang(1-7)水平(n=6)。结果:1、对于缺血1小时再灌注模型,腹腔注射dize5.0mg/kg组nss评分及梗死范围显著低于生理盐水对照组,剂量与保护效应呈u形趋势;腹腔注射dize5.0mg/kg组mda水平显著低于生理盐水对照组;tunel染色显示腹腔注射dize组阳性细胞比例显著低于生理盐水对照组,且伴随caspase3水平下降;2、对于缺血2小时再灌注模型,腹腔注射dize5.0mg/kg组nss评分、梗死范围及mda水平均未见与生理盐水对照组间存在显著差别;3、从血浆浓度差异来看,dize组血浆ang(1-7)浓度显著高于生理盐水组(1.260±0.449,0.861±0.401ng/ml,p<0.01),其余指标在两组间均无显著差异;而脑组织中dize处理组及生理盐水对照组间三指标均未见显著差异。结论:1、再灌注时腹腔注射dize5.0mg/kg可减轻大鼠缺血1小时再灌注后氧化应激程度及细胞凋亡;2、腹腔注射dize可显著上调24小时血浆ang(1-7)水平。第三部分DIZE对神经元糖氧剥夺/再灌注后细胞凋亡的影响目的:建立原代神经元糖氧剥夺/再灌注(OGD/R)诱导细胞凋亡模型,评价DIZE是否具有ACE2非依赖性保护作用。方法:1、获取、分离、培养新生大鼠皮层原代神经元并进行纯化,通过尼氏染色鉴定神经元比例;2、DIZE对原代神经元OGD/R损伤的影响。将神经元分为5组,分别予以:(1)正常培养;(2)OGD/R+正常培养;(3)OGD/R+DIZE 0.1μM;(4)OGD/R+DIZE 1.0μM;(5)OGD/R+DIZE 10.0μM,于24小时后通过AnnexinⅤ-PI双染流式细胞学评估细胞凋亡程度;通过western blot检测各组cl-caspase 3水平;每项指标设置3个平行重复。结果:1、尼氏染色显示神经元比例约为83.9±5.2%;2、与阴性对照组相比,OGD/R处理后细胞凋亡显著,流式细胞学显示DIZE 1.0及10.0μM组凋亡程度显著低于空白对照组。Western blot显示空白处理组cl-caspase 3水平显著高于正常培养组。结论:DIZE可抑制原代神经元糖氧剥夺/再灌注后细胞凋亡。