论文部分内容阅读
研究背景和目的:γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然活性成分,广泛分布于动植物体内,如:米胚芽、米糠、茶和乳酸菌、酵母等。GABA具有很多重要的生理功能,如镇静神经、抗焦虑、调节激素分泌、降血压、抗衰老等。近年来有研究表明,GABA对肝癌、肺癌、胰腺癌和胆管癌等具有较好的抗肿瘤活性,但其对结直肠癌的应用效果及其分子机制研究较少,鉴于此,本课题首先利用细胞实验,探讨GABA对结直肠癌细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭的影响及其分子机制,其次利用细胞和动物实验,探讨GABA对结直肠癌化疗敏感性的影响,为GABA在结直肠癌的预防和辅助治疗中的应用提供理论依据。研究方法:本研究选用三株结直肠癌细胞（SW620、SW480、HCT116）,利用CCK-8、流式细胞技术及Transwell迁移和侵袭等方法观察GABA对三种结直肠癌细胞的增殖、细胞周期及迁移和侵袭的影响;在此基础上,利用RNA-Seq筛选GABA处理三种细胞后的差异表达基因,并采用qRT-PCR对测序结果进行验证;采用qRT-PCR检测GABA对其A、B型受体在结直肠癌细胞中的mRNA水平表达的影响;利用CCK-8方法在体外观察GABA与5-氟尿嘧啶、奥沙利铂化疗药联用对细胞增殖的影响;利用SW480细胞株,构建裸鼠皮下结直肠癌荷瘤小鼠模型,将GABA与奥沙利铂联合应用于荷瘤小鼠,通过观察肿瘤生成情况,免疫组化检测移植瘤组织中Ki67蛋白的表达,Tunel染色法观察裸鼠移植瘤细胞的凋亡情况,探讨GABA与化疗药联用对肿瘤的抑制作用。研究结果:细胞实验中,首先在细胞增殖和细胞周期方面,100?（44）GABA即可显著抑制SW620、SW480、HCT116三种结直肠癌细胞的增殖（P<0.05）,抑制率分别为32.53?7.34%、33.88?2.60%、41.35?10.48%,继续增加GABA浓度至400?（44）,抑制作用未见增强;GABA可使SW620、SW480细胞的S期数量分别减少15%、13%,使HCT116细胞的G1/G0期数量减少10%,G2/M期数量增加30%;GABA可有效抑制SW620、SW480细胞的迁移和侵袭。其次,RNA-Seq筛选及qRT-PCR验证结果显示,GABA可显著下调三种细胞中FOS、FOSB、NR4A1、EGR1、EGR2基因的表达（P（27）0.05）,显著下调FRMD4A基因在HCT116细胞中的表达（P（27）0.0001）,上调FRMD4A基因在SW620、SW480细胞中的表达（P（27）0.0001）;qRT-PCR结果显示GABA可显著影响其A、B型受体在三种细胞中的mRNA表达水平（P<0.05）(即SW620:GABAA?2、GABAAδ上调,GABAAγ2下调;SW480:GABAAδ上调,GABAAε、GABAB1下调;HCT116:GABAA?2、GABAA?3、GABAAβ3、GABAB2、GABAAβ2、GABAAγ2下调)。最后,GABA与5-氟尿嘧啶联用后,对SW620、SW480及HCT116细胞增殖的抑制率分别增加6.28?4.13%、2.03?1.71%、2.68?2.19%;与奥沙利铂联用后,对SW620、SW480及HCT116细胞增殖的抑制率分别增加2.75?2.69%、4.10?2.48%、7.28?1.54%。动物实验研究结果表明,与奥沙利铂组相比,GABA与奥沙利铂联用后,可显著抑制肿瘤的生长,减少移植瘤组织中Ki67蛋白的表达并促进移植瘤细胞的凋亡。结论:GABA可能通过下调FOS、FOSB、NR4A1、EGR1、EGR2基因,上调FRMD4A基因或介导GABAA?2、GABAA?3、GABAAβ2、GABAAβ3、GABAAδ等受体的表达,影响结直肠癌细胞的增殖、细胞周期、迁移和侵袭,同时GABA还增强结直肠癌细胞对化疗药5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的化疗敏感性,表明GABA在结直肠癌的预防和辅助治疗中可发挥重要的作用。