论文部分内容阅读
酪氨酸酶是一种含铜氧化酶,广泛存在于微生物、动物和植物中,是黑色素合成途径中的关键限速酶。在食品工业中,酪氨酸酶催化酚类化合物的酶促氧化反应是导致生鲜水果、蔬菜和饮料等食品褐变的主要原因。使用抑制剂抑制酪氨酸酶的活性是保持新鲜食品营养价值、延长保质期的一种有效的方法。然而,由于有效性、安全性以及成本等因素的限制,目前仅有少许的酪氨酸酶抑制剂被应用于食品工业中。因此,开发新型、稳定、安全、高效的酪氨酸酶抑制剂在食品领域具有广泛的应用前景。本论文围绕导致食品变质的酶促褐变反应、微生物致腐作用和食品氧化变质三大要素,设计、合成出兼具有抗菌、抗氧化和抗酪氨酸酶活性的新型多功能酪氨酸酶抑制剂,并阐明其抗酪氨酸酶、抗氧化及抗菌的作用机制,探求其在食品保鲜领域中的作用功效和应用前景。主要研究内容及结果如下:（1）新型单功能酪氨酸酶抑制剂的设计、合成与活性研究基于活性结构官能团杂合的设计理念,将酪氨酸酶抑制活性官能团曲酸和芳醛杂合到一起,构建出一类结构新颖的曲酸-芳醛类衍生物（系列Ⅰ）,并评价其对酪氨酸酶的抑制活性。结果显示大部分的目标化合物都具有较强的酪氨酸酶抑制活性,其中化合物Ⅰ-j的抑制活性最强IC50为5.32±0.23μM,是阳性对照曲酸的9倍。采用酶抑制动力学、荧光淬灭光谱法、ANS结合荧光光谱法和分子对接法对化合物Ⅰ-j抑制酪氨酸酶的作用机制进行了研究,证实了其能够靶向于酪氨酸酶的活性位点,是一种新型的非竞争性酪氨酸酶抑制剂,并且化合物Ⅰ-j中的羟基是与酶活性中心发生作用的关键基团,直线型结构活性更强,为后续的研究指明了方向。在鲜切苹果抗褐变的研究中,化合物Ⅰ-j呈现出比阳性对照曲酸更强的抗褐变保鲜作用效果。细胞毒性实验证实了这个化合物毒性较低,具有进一步研究和开发的潜力。（2）兼具抗菌功能的新型双功能酪氨酸酶抑制剂的设计、合成与活性研究以系列Ⅰ化合物为基础,通过引入具有抗菌活性的缩胺基硫脲活性官能团,设计并合成得到一类新型的曲酸-缩胺基硫脲类化合物（系列Ⅱ）,并采用~1H NMR、13C NMR和HRMS进行了结构鉴定。体外抑制酪氨酸酶活性筛选结果显示,相比于阳性对照曲酸,所有的目标化合物都具有较强的酪氨酸酶抑制活性,IC50值范围为1.99±0.19μM～45.14±6.25μM。其中以化合物Ⅱ-j(IC50=1.99±0.19μM)的活性最强,是阳性对照曲酸的23倍。采用酶抑制动力学、铜离子螯合实验、荧光淬灭实验、紫外光谱实验、AFM实验和分子对接实验等对化合物Ⅱ-j抑制酪氨酸酶的作用机制进行了研究。抗菌实验研究结果显示,化合物Ⅱ-j对V.Parahaemolyticus具有较好的抗菌活性MIC为0.13 m M。时间-杀灭动力学、细菌细胞膜的完整性和通透性、膜蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳、膜蛋白荧光光谱等实验证实了此化合物能够使细菌细胞膜发生破裂,抑制细菌生长。南美白对虾保鲜实验结果显示,化合物Ⅱ-j具有抑制细菌生长和防止虾褐变的双重作用效果。此外,化合物Ⅱ-j对人正常细胞毒性较低。因此,本研究制备得到了一类兼具有抗菌活性的新型双功能酪氨酸酶抑制剂,可以作为研发新型双功能酪氨酸酶抑制剂的先导化合物,为以后的研究和开发打下了基础。（3）兼具抗氧化功能的新型双功能酪氨酸酶抑制剂的设计、合成与活性研究基于系列Ⅰ化合物的线性结构特征,通过引入抗氧化活性官能团3-巯基-4-氨基-1,2,4-三氮唑,设计并合成得到一类新型的1,2,4-三唑-腙型化合物（系列Ⅲ）。酪氨酸酶抑制活性研究显示,大多数化合物对酪氨酸酶表现出较强的抑制活性。其中化合物Ⅲ-i的抑制活性最高(IC50=0.9±0.1μM),其抑制活性约为曲酸的70倍。另一方面,抗氧化活性实验证明,大部分目标化合物都具有较强的抗氧化能力,证实了抗氧化基团的引入可以提高化合物的抗氧化作用。鲜切果蔬抗褐变研究表明,化合物Ⅲ-i对新鲜果蔬具有显著的抗褐变作用,可以作为鲜切果蔬的抗褐变剂进行研究和开发。此外,化合物Ⅲ-i对人正常细胞系（HEK293）表现出极低的细胞毒活性,说明其安全性较好。因此,本研究发现了一种兼具抗氧化功能的新型酪氨酸酶抑制剂,有望作为抗褐变剂应用于食品等行业中。（4）新型三功能酪氨酸酶抑制剂的设计、合成与活性研究基于上述三个系列化合物的研究结果,通过引入对位羟基抑酶、羟基抗氧化、苯腙抗菌结构特征,设计并合成到一类具有线性结构特征的没食子酸-苯腙类化合物（系列Ⅳ）。在这些化合物中,化合物Ⅳ-d和Ⅳ-f具有较强的酪氨酸酶抑制活性IC50分别为15.28μM和3.29μM,优于阳性对照曲酸。DPPH自由基清除能力实验、ABTS自由基清除能力实验和Fe3+还原力实验证实了化合物Ⅳ-d和Ⅳ-f具有较强的抗氧化活性,其抗氧化活性优于阳性对照Vc。抗菌活性研究实验显示,相比于阳性对照曲酸,化合物Ⅳ-d和Ⅳ-f对V.parahaemolyticu和S.aureus都具有较强的抑制活性。并且,化合物Ⅳ-d和Ⅳ-f对新鲜果蔬、南美白对虾和新鲜虾仁都具有显著的抗褐变保鲜作用。同时,化合物Ⅳ-d和Ⅳ-f对人正常细胞系（HEK293）呈现较低的毒性,化合物Ⅳ-f在小鼠急性毒性实验中也表现出较好的安全性。因此,这些化合物同时具有抑制酪氨酸酶、抗氧化和抗菌活性,可以作为研究和开发新型多功能酪氨酸酶抑制剂的先导化合物。