论文部分内容阅读
副溶血弧菌是全球范围内主要的食源性致病菌之一，人们食用受副溶血弧菌污染的水产品后会引发食物中毒和急性肠炎，严重威胁人类健康和食品安全问题。凡纳滨对虾是世界对虾养殖最主要的经济品种之一，弧菌病是目前影响凡纳滨对虾养殖业最常见和爆发最频繁的一种细菌性疾病，给全球凡纳滨对虾养殖产业造成了严重的危害和巨大的经济损失。 MicroRNA（miRNA）是一类长度为20-24nt的内源性非编码小RNA，通过与靶基因的3′UTR结合，在转录后水平对靶mRNA进行调控，导致mRNA降解或抑制翻译；miRNA在很多生物学过程中发挥重要作用，包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、发病机制、抵抗疾病、肿瘤发生和免疫反应等过程。最近研究发现，miRNA在抗细菌感染和病毒感染过程中也发挥着重要作用。 近年来，第二代高通量测序技术已被广泛应用于检测特定组织或特定细胞在特定状态下，所有表达的RNA转录本，为研究和揭示无参考基因组的非模式生物（例如甲壳类动物）抵抗病原微生物感染免疫反应的分子机制提供了一种非常有效的方法。到目前为止，已有关于凡纳滨对虾抗病毒或细菌感染的独立的转录组测序和独立的小RNA测序，在凡纳滨对虾中鉴定出了一些与病毒或细菌感染相关的mRNA和miRNA；但是，在凡纳滨对虾中与副溶血弧菌感染相关mRNA和miRNA联合分析的研究尚未见报道。 本研究以感染和未感染副溶血弧菌12h凡纳滨对虾的肝胰腺为研究对象，构建3个感染和3个未感染状态下肝胰腺的小RNA文库和转录组文库，即对照组：C1、C2、C3，处理组：T1、T2、T3，共构建6个转录组文库和6个小RNA文库。利用Illumina Hiseq2500高通量测序平台，分析鉴定凡纳滨对虾肝胰腺中与副溶血弧菌感染相关的差异表达的miRNA和mRNA，对差异表达的miRNA和mRNA进行联合分析，探讨miRNA和mRNA在副溶血弧菌感染中互作关系；并对有潜在互作关系的差异表达的miRNA和mRNA利用荧光定量PCR的方法进行分析验证。结果显示： （1）通过Illumina HiSeq2500高通量测序平台，对所构建的6个转录组文库进行双末端测序，每个转录组文库获得的raw reads都超过58M，去除低质量的reads后，每个转录组文库获得的clean reads都超过56M，clean reads占raw reads的比例都超过96%。6个库的Q20均大于97%，Q30大于93%，GC含量均在50%左右。通过Trinity软件拼接，共得到139172个转录本和77516个单基因簇。77516个unigenes在NR、NT、KEGG、Swiss-prot、PFAM、GO和KOG七大数据库中的注释比例在19%-45%范围内变化，其中有5747个unigenes被七大数据库共同注释，至少在一个数据库中被注释的unigenes有43334个。 （2）通过转录组测序，一共鉴定出4778个差异表达的mRNAs，包括3233个显著上调表达mRNAs和1545个显著下调表达mRNAs。对这些差异表达mRNA进行KEGG通路富集分析，发现它们主要富集在癌症、细胞生长和死亡、信号转导以及复制和修复等39条信号通路中。 （3）通过Illumina HiSeq2500高通量测序平台，对所构建的6个小RNA文库进行测序，每个小RNA文库获得的raw reads都超过23M，去除掉低质量的reads后，6个小RNA文库获得clean reads都超过23M，clean reads占raw reads的比例均超过95%，6个小RNA文库的Q20均大于98%，Q30大于97%，GC含量都在50%左右。 （4）通过小RNA测序，共鉴定出155个已知的miRNAs和55个新预测的miRNAs。通过差异表达分析，一共获得25个差异表达的miRNAs，包括12个显著上调表达的新预测的miRNAs和13个已知miRNAs，其中7个表达显著下调，6个表达显著上调。 （5）采用miRanda软件对25个差异表达的miRNAs的靶基因进行预测，共预测到14998个不同的靶基因，分为三组，G1：942个靶基因仅由下调miRNA靶向调控；G2：10453个靶基因仅由上调miRNA靶向调控；G3：3603个靶基因同时由上调和下调的miRNA靶向调控。对14998个靶基因进行KEGG通路分析，发现这些靶基因显著富集到癌症、焦点黏连、慢性髓性白血病、急性髓性白血病、凋亡、MAPK、Jak-STAT等46条信号通路中。 （6）对显著下调的miRNA和显著上调的mRNA进行联合分析，获得了由7个下调miRNAs和373个上调mRNAs组成的891对miRNA和mRNA的互作关系。对373个靶mRNAs进行KEGG通路富集分析，发现它们主要富集到PI3K-Akt、Ras、MAPK、癌症、DNA复制、核苷酸切除修复、错配等17条信号通路中。 （7）对显著上调的miRNA和显著下调的mRNA进行联合分析，获得了由6个上调miRNAs和236个下调mRNAs组成的349对miRNA和mRNA的互作关系，对236个靶mRNAs进行KEGG通路富集分析，发现它们主要富集到了脂质代谢、消化系统、内分泌系统中的16条信号通路中。 （8）对差异表达免疫相关的mRNA和miRNA进行联合分析，共获得了由11个差异表达的miRNAs和18个差异表达免疫相关的靶mRNAs组成的35对互作关系，包括15对正调控互作关系和20对负调控互作关系。用荧光定量PCR对由7个miRNAs（ame-miR-9b、bmo-miR-79-3p、dme-miR-315-5p、isc-miR-315、sko-miR-315、mja-miR-6494、sme-miR-750-3p）和11个靶mRNAs（CTLCDP、GILT、RhoGAPp190、GAP、ERp57、RPC5、DOCK2、PTPN11、Btk29A、AF6、GTPBP）组成的20对负调控互作关系进行验证，验证结果与预测结果一致，7个miRNAs的调控方向与11个靶mRNAs的调控方向相反。 （9）在差异表达免疫相关的mRNA和miRNA的联合分析过程中，获得了18个差异表达免疫相关的靶mRNAs（CTLCDP、SPS、GILT、RhoGAPp190、GAP、ERp57、RPC5、PI3KR、TIAM1、DOCK2、PTPN11、MAP3K7、BRAF、Btk29A、AF6、GTPBP、FYN、PXN），对18个靶mRNAs进行KEGG通路富集分析，发现它们主要富集到免疫系统中的趋化因子信号通路；癌症通路中的慢性髓性白血病信号通路；信号转导通路中的MAPK信号通路、cAMP信号通路；发育通路中的破骨细胞分化和轴突导向等15条通路中。 综上所述，对感染和未感染副溶血弧菌12h的凡纳滨对虾的肝胰腺进行转录组和小RNA测序，共鉴定出4778个差异表达mRNAs和25个差异表达miRNAs。7个差异表达miRNAs和11个差异表达免疫相关靶mRNAs在副溶血弧菌处理后12h有互作关系。18个差异表达免疫相关靶mRNAs，在凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染的免疫应答中均发挥重要作用。miR-9家族（ame-miR-79、bmo-miR-79-3p、ame-miR-9b）和miR-315家族（dme-miR-315-5p、isc-miR-315、sko-miR-315）以及mja-miR-6494和sme-miR-750-3p在副溶血弧菌感染中发挥重要调控作用。凡纳滨对虾为抵抗副溶血弧菌的感染增强了与免疫、疾病、代谢相关基因的表达，降低了与消化吸收内分泌相关基因的表达。免疫系统、癌症、信号转导和细胞群落等通路都参与了凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染的免疫应答过程。本研究结果将扩大凡纳滨对虾与副溶血弧菌感染相关miRNAs和mRNAs的列表，为深入研究miRNA和mRNA在弧菌感染中的作用机制以及提高凡纳滨对虾对副溶血弧菌感染的遗传抗性奠定基础。