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目的:1.探讨miR-31对结肠炎的促进作用是否通过靶向SATB2。2.使用miR-31过表达的转基因小鼠,探讨miR-31促进结肠炎的分子机制。方法:1.SATB2敲低实验:将人结肠上皮细胞HCT 116分为control组、miR-31过表达组(转染miR-31 mimic,使miR-31过表达)、miR-31敲低组(转染miR-31 inhibiror,抑制miR-31的表达)、si-SATB2组(转染SATB2 siRNA,抑制SATB2的表达)。使用脂质体瞬时转染后将细胞放入CO2孵箱中,孵育72h后收取细胞。qRT-PCR检测siRNA的转染效率和最佳转染浓度;Western Blot检测4组细胞SATB2、NF-κB、COX-2、TGF-β1蛋白的表达。2.SATB2过表达实验:将人结肠上皮细胞HCT 116分为control组、pEXP-RB-Mam组(转染空载体)、pEXP-RB-Mam-SATB2组(转染SATB2过表达质粒),待细胞贴壁后使用lip2000进行转染,转染后将细胞放入CO2孵箱中孵育,6h后进行换液,72h后收集细胞。Western Blot检测3组细胞SATB2、NF-κB、COX-2、TGF-β1蛋白的表达。3.动物实验:14只非转基因小鼠随机分为control组(n=6)、DSS组(n=8),16只miR-31过表达的转基因小鼠随机分为miR-31过表达control组(n=8)、miR-31过表达+DSS组(n=8)。DSS组和miR-31过表达+DSS组第一周饮用1%的DSS,第二周饮用正常无菌水为一个cycle,重复两个半cycle造模结束。留取小鼠结肠组织,Western Blot检测小鼠结肠组织SATB2、TLR4、NF-κB、COX-2、TNF-α、iNOS、Bax、Bcl-2蛋白的表达;免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)检测小鼠结肠组织SATB2、TLR4、NF-κB、COX-2、TNF-α、Bax、Bcl-2蛋白的表达;原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测小鼠结肠组织细胞凋亡。结果:1.siRNA的转染效率和最佳转染浓度:qRT-PCR结果显示,HCT 116细胞转染SATB2 siRNA后,SATB2的表达显著下降(P<0.01),证明SATB2 siRNA转染有效。同时,siRNA浓度为3nM时,SATB2的表达量已有显著降低,当siRNA浓度升为5nM时,SATB2的表达量相比3nM也显著降低,并且低于10nM的siRNA,因此我们将5nM作为后续转染SATB2 siRNA的最佳浓度。2.SATB2蛋白表达结果:Western Blot结果显示,对HCT 116细胞进行转染后,与control组相比,mimic组和si-SATB2组SATB2蛋白表达水平显著下降(P<0.01),inhibitor组SATB2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),进一步证明了转染成功。3.炎性因子NF-κB、COX-2、TGF-β1蛋白的表达结果:Western Blot结果显示,与control组相比,mimic组NF-κB、COX-2蛋白表达显著升高(P<0.05),TGF-β1蛋白表达显著降低(P<0.01),inhibitor组NF-κB、COX-2蛋白表达显著降低(P<0.01),si-SATB2组NF-κB、COX-2蛋白表达显著升高(P<0.01),TGF-β1蛋白表达显著降低(P<0.01)。4.SATB2过表达质粒的转染效率:Western Blot结果显示,对HCT 116细胞转染SATB2过表达质粒后,pEXP-RB-Mam组与control组相比,SATB2蛋白表达水平无显著差异,pEXP-RB-Mam-SATB2组SATB2蛋白表达水平较control组显著升高(P<0.01)。证明SATB2过表达质粒转染有效。5.SATB2过表达后NF-κB、COX-2、TGF-β1蛋白的表达结果:Western Blot结果显示,pEXP-RB-Mam组NF-κB、COX-2、TGF-β1蛋白表达水平相比control组无显著差异,pEXP-RB-Mam-SATB2组与control组相比,NF-κB(P<0.01)、COX-2(P<0.05)蛋白表达水平显著降低,TGF-β1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。6.小鼠结肠组织SATB2蛋白的表达:Western Blot结果显示,与control组相比,DSS组(P<0.01)和miR-31过表达组(P<0.05)SATB2蛋白表达水平均显著下降,同时与DSS组相比,miR-31+DSS组SATB2蛋白表达水平也显著下降。7.Western Blot检测小鼠结肠组织TLR4、NF-κB、iNOS、TNF-α蛋白的表达:结果显示,与control组相比,DSS组TLR4、NF-κB、iNOS、TNF-α蛋白的表达显著升高(P<0.01),miR-31过表达组TLR4(P<0.05)、NF-κB(P<0.05)、iNOS(P<0.01)蛋白的表达也显著升高,同时与DSS组相比,miR-31+DSS组TLR4、NF-κB、iNOS、TNF-α蛋白表达水平也显著升高(P<0.01)。8.IHC检测小鼠结肠组织TLR4、NF-κB、COX-2、TNF-α蛋白的表达:结果显示,与control组相比,DSS组TLR4、NF-κB、COX-2、TNF-α蛋白的表达显著升高(P<0.01),miR-31过表达组TLR4(P<0.01)、NF-κB(P<0.01)、COX-2(P<0.05)、TNF-α(P<0.01)蛋白的表达也显著升高,同时与DSS组相比,miR-31+DSS组TLR4、NF-κB、COX-2、TNF-α蛋白表达水平也显著升高(P<0.01)。9.TUNEL法检测小鼠结肠组织细胞凋亡结果:结果显示,与control组相比,DSS组和miR-31过表达组凋亡细胞均显著增加(P<0.01),同时与DSS组相比,miR-31+DSS组凋亡细胞也显著增加(P<0.01)。10.Western Blot检测小鼠结肠组织Bax、Bcl-2蛋白的表达:结果显示,与control组相比,DSS组Bax蛋白表达水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白蛋白表达水平下降(P<0.01),Bcl-2/Bax比值下降(P<0.01),miR-31过表达组Bax蛋白表达水平升高(P<0.05),Bcl-2/Bax比值下降(P<0.01),同时与DSS组相比,miR-31+DSS组Bax蛋白表达水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白蛋白表达水平下降(P<0.01),Bcl-2/Bax比值下降(P<0.01)。11.IHC检测小鼠结肠组织Bax、Bcl-2蛋白的表达:结果显示,与control组相比,DSS组Bax蛋白表达水平升高(P<0.01),Bcl-2蛋白蛋白表达水平下降(P<0.01),miR-31过表达组Bax蛋白表达水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平下降(P<0.01),同时与DSS组相比,miR-31+DSS组Bax蛋白表达水平升高(P<0.01),Bcl-2蛋白蛋白表达水平下降(P<0.01)。结论:1.miR-31可通过靶向SATB2来发挥对结肠炎的促进作用。2.miR-31通过促进TLR4/NF-κB信号通路来介导肠上皮细胞凋亡促进结肠炎的发展。