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研究背景：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染所致的慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure, ACLF)是临床常见的危重症,病死率较高,对人类危害严重。关于ACLF的发病机制,目前认为主要包括病毒复制和宿主免疫反应及其相互作用两个方面,但是HBV无直接致细胞病变效应,其本身并不直接对感染细胞产生破坏效应,由此人们认为ACLF发病机制的主要环节为病毒在一定条件下所诱发的宿主免疫应答异常。微小RNA(microRNA, miRNA)是近年来新发现的一类非编码小分子RNA。miRNA表达丰富,作用广泛,胚胎发育、细胞增殖分化均受miRNA的调控,同时miRNA也参与机体免疫反应的调节。miRNA可以通过Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)与细胞因子信号途径对机体固有免疫进行调控,也可通过干扰抗原呈递及T细胞受体(T cell receptors, TCRs)途径对机体适应性免疫进行调控。作为机体免疫应答的始动者,miRNA在HBV感染发病机制中的作用也日益得到重视。多项研究已经证实,多个miRNA参与控制HBV复制、HBV相关肝脏疾病的进展,尤其是肝硬化和肝细胞癌的进展；也有研究发现对于接受干扰素(interferon,IFN)治疗的慢性HBV或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染者,可利用患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中miRNA表达水平的变化来协助判断疾病的临床转归。然而关于miRNA与ACLF的关系,目前知之甚少。研究目的：(1)了解肝脏炎症程度不同的慢性HBV感染者PBMC中miRNA的表达谱。(2)确认慢性HBV感染者PBMC中是否存在与肝脏炎症程度相关的特异性miRNA。(3)对特异性miRNA可能的靶基因进行预测,了解慢性HBV感染者PBMC中特异性miRNA靶基因的表达水平。(4)对miR-197、miR-328的靶基因进行确认,初步探讨慢性HBV感染者体内]miR-197、miR-328的作用途径。研究方法：(1)应用miRNA基因芯片技术对HBV相关的4例无症状携带者(asymptomatic carrier, ASC)及4例ACLF患者PBMC中miRNA的表达谱进行检测,对差异性表达的miRNA进行筛选。(2)采用TargetScan5.2,DIANA-microT3.0及Pictar生物软件对miR-197、 miR-328的靶基因进行预测。(3)采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)对HBV相关的70例ASC,107例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者,76例ACLF患者,及51例健康对照者PBMC中miR-150、miR-197、 miR-223、miR-328、miR-30a、miR-574-3p的表达水平进行验证分析；同时对PBMC中miR-197的靶基因白细胞介素18(interleukin18,IL18)、肿瘤坏死因子配体超家族10(tumor necrosis factor ligand superfamily member10, TNFSF10), miR-328的靶基因肿瘤坏死因子受体超家族9(tumor necrosis factor receptor superfamily member9, TNFRSF9)的mRNA表达水平进行检测。(4)采用基因瞬时转染的方法,分别将miR-197mimic和inhibitor; miR-328mimic和inhibitor转染至单核细胞系THP-1细胞中,采用CCK-8法检测各转染组及对照组细胞增殖率；酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测各转染组及对照组细胞培养上清中IL18表达水平;应用real-time PCR检测各转染组及对照组miR-328, miR-197与TNFRSF9、TNFSF10、IL18的mRNA表达水平；western blot检测各转染组及对照组TNFRSF9、TNFSF10的蛋白表达水平。研究结果：(1)miRNA基因芯片检测显示慢性HBV感染所致的ASC与ACLF患者PBMC中共有17个miRNAs出现差异性表达,与ASC患者相比较,肝脏炎症活动明显的ACLF患者PBMC中hsa-miR-1246、hsa-miR-30a、hsa-miR-1305、hsa-miR-193a-3p和hsa-miR-196b共5个miRNAs表达上调,同时hsa-miR-223、 hsa-miR-574-3p、hsa-miR-150等12个miRNAs表达下调。(2)对肝脏炎症程度不同的慢性HBV感染者PBMC中miRNA的表达水平扩大样本进行验证分析发现,miR-197、miR-574-3p及miR-30a的PCR验证分析结果与miRNA基因芯片分析结果一致,而miR-150、miR-223与miR-328的PCR验证分析结果与miRNA基因芯片分析结果存在一定的差异。验证分析显示随着慢性HBV感染者肝脏炎症程度的逐渐加重,miR-197的表达水平逐渐下调,而miR-328的表达水平逐渐上调。同时,正常对照组PBMC中miR-574-3p、miR-30a的表达水平较慢性HBV感染者明显升高;而与正常对照组相比较,ACLF患者PBMC中miR-150表达上调；但是各组间miR-223的表达水平无明显差异。(3)TargetScan5.2等靶基因预测软件分析发现,miR-197可与TNFRSF9、TNFSF10、IL18的3’非编码区(untranslated region,UTR)互补配对,miR-328可与TNFRSF9的3’UTR互补配对。肝脏炎症程度不同的慢性HBV感染者PBMC中,TNFRSF9的表达水平随肝脏炎症程度的加重而降低,与1miR-328的表达水平趋势相反；TNFSF10、IL18的表达水平随肝脏炎症程度的加重而增加,与miR-197的表达水平趋势相反。(4)与空白转染组及mimic control (miR-C)转染组,inhibitor control (anti-miR-C)转染组相比较,miR-197mimic转染组中IL18、TNFRSF9、TNFSF10的mRNA及蛋白表达水平均降低,有显著性差异；miR-197inhibitor转染组中IL18的mRNA及蛋白表达水平均增加,有显著性差异；虽然miR-197inhibitor转染组中TNFRSF9的mRNA表达水平明显增加,但是其蛋白表达水平并没有显著增加；同时,miR-197inhibitor转染组中TNFSF10的1mRNA表达水平明显增加,但是其蛋白表达水平并没有显著增加；与空白转染组及miR-C转染组,anti-miR-C转染组相比较,miR-328mimic转染组中TNFRSF9的mRNA及蛋白表达水平均降低,有显著性差异；miR-328inhibitor转染组中TNFRSF9的mRNA及蛋白表达水平均增加,有显著性差异。结论：(1)miRNA基因芯片检测技术的重复性欠佳,miRNA表达谱的确定需结合real-time PCR检测技术综合分析。(2)慢性HBV感染者PBMC中存在与肝脏炎症程度相关的特异性miRNA,这些miRNA(尤其是1miR-197,miR-328)参与HBV的发病,可能是慢性HBV相关肝脏炎症程度的潜在生物学标志之一。(3)慢性HBV感染者PBMC中IL18、TNFRSF9、TNFSF10的表达水平与肝脏炎症程度存在一定的联系。(4)miR-197可对IL18的mRNA及蛋白表达水平产生负性调节作用：miR-328可对TNFRSF9的mRNA及蛋白表达水平产生负性调节作用。(5)]miR-197可对TNFRSF9的mRNA表达水平产生负性调节作用。(6)1miR-197可对TNFSF10的mRNA表达水平产生负性调节作用。(7)可能miR-197通过下调IL18的表达,miR-328通过下调TNFRSF9的表达参与慢性HBV感染后的发病。