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背景环境污染目前已经变成严重的全球问题,周围环境中的颗粒污染物严重超标,危害人类的健康,引起炎症性皮肤病、皮肤老化甚至皮肤癌。流行病学调查显示;大气环境污染与外部皮肤老化有显著相关性,尤其是色斑和皱纹。环境颗粒污染物的形态和组成相当复杂,但是多环芳烃化合物引起皮肤危害的作用机制并不清楚。目的本课题利用一种主要成分为多环有机化合物的空气颗粒性污染物(PAHs的国际标准品SRM1649b浸出液),采用不同浓度标准品SRM1649b的浸出液作用于永生化的皮肤角质形成细胞HaCaT细胞及皮肤成纤维细胞(NHDF),检测分析其老化相关分子标志、信号通路的分子及基因表达水平,旨在探索PM2.5的空气颗粒性污染物中的多环芳烃化合物是否引起正常人表皮角质形成细胞及皮肤成纤维细胞老化的作用,明确多环芳烃化合物引起皮肤细胞老化的具体分子机制。方法1.多环芳烃化合物对表皮真皮细胞毒性效应分析:永生化的皮肤角质形成细胞HaCaT细胞和皮肤成纤维细胞NHDF细胞为研究对象,以国际标准品空气颗粒性污染物多环芳烃化合物SRM1649浸出液为刺激物。研究不同时间条件下(0小时、6小时、12小时、24小时,36小时,48小时)不同浓度SRM1649b对HaCaT细胞和NHDF细胞增殖活性的影响。传代HaCaT细胞和NHDF细胞,显微镜下观察有70-80%的细胞融合时用于实验,吸去原培养液,加入专用培养基,稀释SRM1649b,使其终浓度为(0、50、100、200、400ug/mL),在不同浓度,不同时间条件下避光孵育,用CCK8法检测不同时间点和浓度孵育SRM1649b对HaCaT细胞和NHDF细胞增殖活性的影响;从而探索出不同浓度,和不同时间点SRM1649b浸出液对HaCaT及NHDF细胞生存率的影响并选择适宜的实验浓度;2.采用流式细胞术检测SRM1649b对HaCaT和NHDF的细胞周期,及凋亡的影响。采用细胞免疫荧光法观察SRM1649b浸出液刺激前后HaCaT和NHDF细胞内芳香族化合物受体AhR的分布变化;3.用实时荧光定量PCR方法检测各浓度实验组HaCaT和NHDF细胞中基质金属蛋白酶MMP1,MMP3,MMP9的mRNA表达情况。用Western-blot方法检测各浓度实验组HaCaT和NHDF细胞中基质金属蛋白酶MMP1蛋白表达情况。用ELISA法检测基质金属蛋白酶MMP1蛋白的细胞外分泌情况;4.实时荧光定量PCR和Western-blot方法检测PAHs(SRM1649b浸出液)与受体(AhR)结合后引起的胞浆及核内下游靶基因的变化,包括ERK1/2,c-Jun等调控分子的磷酸化水平,以及CYP1A1等下游靶基因的mRNA表达水平;5.我们研究分析加入AhR受体拮抗剂后对HaCaT和NHDF中MMP1,CYP1A1等表达的影响。结果1.SRM1649b浸出液抑制HaCa T和NHDF细胞的增殖:CCK8实验结果显示与对照组相比当SRM1649b孵育时间逐渐延长的时候,HaCa T和NHDF细胞的增殖能力减弱。SRM 1649b的浓度越高,HaCaT和NHDF细胞的增殖能力越低;2.SRM1649b浸出液促进HaCaT和NHDF细胞凋亡:流式细胞术(FCM)检测结果显示:与对照组相比,SRM1649b浸出液处理后抑制HaCa T和NHDF细胞周期的进程,使细胞发生G1/S期阻滞,调控细胞周期G1到S期的关键蛋白Cyclin A和Skp2蛋白表达下调。与对照组相比,SRM1649b浸出液处理后,HaCaT和NHDF细胞的凋亡率明显的增加;3.SRM1649b浸出液上调细胞内MMP1蛋白表达:实时荧光定量PCR结果显示:与对照组相比,HaCaT和NHDF细胞中基质金属蛋白酶MMP1,MMP3和MMP9的mRNA表达上调。ELISA法检测显示基质金属蛋白酶MMP1的蛋白表达上调;4.SRM1649b浸出液导致芳香族化合物受体AhR核转位:细胞免疫荧光结果显示:SRM1649b浸出液刺激后,HaCaT和NHDF细胞内芳香族化合物受体AhR进入细胞核分布明显;5.SRM1649b浸出液激活ERK/MAPK信号通路:Western-blot检测结果显示:与对照组相比SRM1649b浸出液处理组ERK/MAPK信号通路中的相关蛋白p-ERK1/2,p-c-Jun磷酸化水平上调。其下游靶基因CYP1A1,MMP1的mRNA表达水平上调;6.研究发现加入AhR受体拮抗剂后抑制SRM1649b对HaCa T和NHDF中MMP1,CYP1A1等基因的表达上调。结论在一定浓度范围内,多环芳烃化合物空气颗粒性污染物SRM1649b浸出液可以引起皮肤角质形成细胞和皮肤成纤维细胞增殖减弱,及细胞周期发生G1/S期阻滞,调控细胞周期G1到S期的关键蛋白CyclinA和Skp2蛋白表达下调。角质形成细胞及皮肤成纤维细胞中与老化相关的基质金属蛋白酶MMP1,MMP3和MMP9的mRNA及ERK/MAPK信号通路下游靶基因CYP1A1的mRNA及蛋白的表达水平上调。上述证据阐明:PM2.5中PAHs与AhR结合后激活ERK/MAPK信号通路、诱导皮肤老化相关的蛋白表达,进一步支持PM2.5可促进皮肤老化。