【摘 要】
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紫苏（Perilla frutescens（L.）Britt.）是一种新型油料作物,因具有丰富的α-亚麻酸而引起越来越多的关注,是我国卫生部首批公布的药食同源作物之一。紫苏种子油中α-亚麻酸高达60%,长期食用有益于身体健康,尤其是在促进大脑发育、预防心血管疾病等方面具有重要作用。溶血磷脂酸酰基转移酶（Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAT）是植物种子
【基金项目】
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国家青年科学基金（31201266）； 国家农业部“948”项目（#2014-Z39）； 山西省自然科学基金项目（2010011039-1）； 山西省重点研发计划项目（201803D221005-9、201603D312005）； 山西省煤基重点科技攻关项目（FT
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紫苏（Perilla frutescens（L.）Britt.）是一种新型油料作物,因具有丰富的α-亚麻酸而引起越来越多的关注,是我国卫生部首批公布的药食同源作物之一。紫苏种子油中α-亚麻酸高达60%,长期食用有益于身体健康,尤其是在促进大脑发育、预防心血管疾病等方面具有重要作用。溶血磷脂酸酰基转移酶（Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAT）是植物种子油脂合成积累过程中的一类关键酶,催化酰基Co A的脂肪酸转移到三酰甘油（triacylglycerol,TAG）的sn-2位上形成磷脂酸（phosphatidic acid,PA）,而且不同类型的LPAT对不同的底物具有选择偏好性,在基因工程上常被用于改善植物油脂肪酸组分。本研究对紫苏转录组数据中LPAT酶基因进行了分析鉴定,检测PfLPATs基因的时空表达特性,筛选出种子中高量表达的基因进行分子克隆,并通过异源表达酵母（Saccharomyces cerevisiae）、本氏烟草（Nicotiana benthamiana）和普通烟草（Nicotiana tobaccum,Sumsun NN（SNN））鉴定其生物学功能,为深入探究LPAT基因在紫苏油脂合成积累过程中的作用机制提供理论基础,同时为油料作物特异性积累C18:1提供了优异的基因元件。主要研究结果如下:1、以拟南芥AtLPATs蛋白序列为探针,在紫苏转录组数据库中进行BLAST检索,共获得11条紫苏PfLPATs基因序列,并对其重新命名,生物信息学分析结果显示,这11条PfLPATs序列均包含完整的编码区,且都具有一个溶血磷脂酸酰基转移酶相似的保守区,编码氨基酸长度在250～384 aa之间,除PfLPAT1定位在叶绿体,其它蛋白均定位在内质网;聚类分析结果表明,紫苏的11条PfLPATs基因序列分属于三个亚类型,其中1型LPAT有1个基因,2/3型LPAT包含4个,4/5型LPAT包含6个,但未发现B型LPAT序列。2、通过RT-PCR和q RT-PCR技术分析了11个PfLPATs基因在‘晋紫苏1号’不同组织和种子发育不同时期的表达谱,结果显示这11个基因在不同组织中均有表达,但表达模式不同,PfLPAT1在花和发育早期种子中相对较高,4/5型LPAT基因整体表达量较低,2/3型LPAT表达量较高,其中PfLPAT2-1和PfLPAT2-3在种子中表达明显高于其他基因,推测其可能参与紫苏种子油脂积累过程。因此,以开花后20天的种子c DNA为模板,用高保真酶成功扩增出PfLPAT2-1和PfLPAT2-3的编码区,长度分别为1155bp和1149bp。3、构建酵母重组表达载体p YES2.0-PfLPAT2-1和p YES2.0-PfLPAT2-3,将PfLPAT2-1和PfLPAT2-3转入INVSc1酿酒酵母,对重组酵母的总脂肪酸含量和脂肪酸组分进行分析,结果表明两种转基因酵母的总脂含量分别升高了1.4%和2.5%,并且转基因酵母中C16:1和C18:1所占比例显著提高,尤其是C18:1分别提高了6.36%和10.27%;进一步通过外源添加脂肪酸（C18:0、C18:1、C18:2和C18:3）分析PfLPAT2-1和PfLPAT2-3的底物选择性,对酵母生长活力和脂肪酸组分进行测定,结果表明这2个基因均对C18:1具有底物特异性选择。4、构建pCAMBIA1303-PfLPAT2-1和pCAMBIA1303-PfLPAT2-3植物重组表达载体,并转入根癌农杆菌GV3101中。瞬时侵染本氏烟草后检测叶片的总脂和脂肪酸成分,结果显示总脂含量显著提高,分别增加了2.1%和3.2%,各脂肪酸组分所占比例发生改变,其中C18:1分别提高6.21%和8.37%,C18:3分别增高3.47%和2.46%,C16:0下降明显。用农杆菌介导的叶盘法将重组载体转入普通烟草中,对转基因烟草叶片的总脂和脂肪酸成分分析,结果表明与转空载叶片对照异源表达紫苏PfLPAT2-1和PfLPAT2-3基因能够提高烟叶总脂肪酸含量,并改变脂肪酸组分含量占比,C18:1含量分别升高10.15%和11.84%,C18:3含量也有升高,进一步说明PfLPAT2-1和PfLPAT2-3对油酸更具有底物偏好性。
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