1993年Tuszynski等利用来源于血小板凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)多肽CSVTCG-琼脂糖亲和层析柱从肺癌细胞中分离得到了一种蛋白质,它可以特异地结合TSP-1的CSVTCG位点,具有抑制新生血管生长的功能,因此将其命名为angiocidin。Blast检索表明,该蛋白质与胞内26S蛋白酶体亚单位S5a,及抗分泌因子序列一致。已有的研究表明：S5a/angiocidin能抗肿瘤、抑制肿瘤新生血管和诱导肿瘤细胞的分化。目前的研究认为：S5a/angiocidin激活单核细胞分泌细胞因子,诱导细胞分化成巨噬细胞样表型,这些作用是通过MAPK、NF-kB和P13K三条信号通路介导的,可见S5a/angiocidin发挥上述功能的第一步—如何作用于细胞的,即直接相互作用的膜蛋白,或在哪个(些)基质蛋白辅助下,形成复合物,再将信号传递与特异膜蛋白的,都还不清楚。本论文将从以下三部分阐述S5a诱导THP-1细胞分化的初步机制。第一部分诱导表达重组MBP-S5a融合蛋白本课题组在已得到高表达S5a/angiocidin的工程菌基础上,经IPTG诱导,得到的表达量占细菌总蛋白的30%以上；重组表达的MBP-S5a融合蛋白经Amylose Resin亲合柱纯化,得到了纯化的融合蛋白MBP-S5a。经Western鉴定在88 kDa得到阳性的融合蛋白表达条带。第二部分S5a诱导THP-1细胞凋亡及分化的检测用MTT法测定不同浓度的MBP-S5a蛋白在24 h、48 h、72 h、96 h对THP-1细胞的增殖抑制率,结果表明增殖抑制效应具有浓度依赖性。而观察不同作用时间时,与相应浓度MBP对细胞的作用相比得出,S5a作用24 h时对细胞增殖抑制作用明显,48 h作用后增殖抑制率显著降低,96 h时S5a对细胞增殖抑制作用消失。根据已有的研究表明S5a具有诱导THP-1细胞分化的作用,推测当S5a作用于THP-1细胞48 h后随着分化细胞的数目增多,S5a对已分化细胞不再具有增殖抑制作用。用流式细胞仪检测S5a作用12 h、24 h、48 h后THP-1细胞凋亡情况,与MBP处理组对比得出,S5a作用24 h时细胞凋亡率显著上升,而48 h作用后细胞凋亡率显著下降,结果与MTT检测相符。进一步观察和检测S5a在48 h、72 h、96 h诱导后细胞形态学和细胞表面分化标志CD14、CD36的表达情况,结果表明,细胞分化效应具有时间依赖性,即随着作用时间的延长THP-1细胞形态发生了明显的变化从悬浮变为贴壁状态,大多数细胞形状不规则并伸出伪足,且细胞表面的CD14+/CD36+表达量显著上升。以上结果证实了之前的推测,即早期(12 h、24 h)S5a能够诱导THP-1细胞凋亡,作用于48 h后,随着部分单核细胞分化成为巨噬细胞,已分化细胞对S5a的诱导凋亡作用不再敏感。第三部分S5a相互作用蛋白的鉴定与初步机制的探讨以THP-1细胞为研究对象,用去污剂CHARPS抽提细胞膜蛋白,通过pull-down捕获与S5a相互作用蛋白；所捕获的分子进行质谱鉴定与分析。在鉴定出的蛋白中DR6引起了我们的关注。DR6是Ⅰ型跨膜蛋白,其典型配体至今还未报道,它仍然是个孤儿受体。推测DR6有可能介导S5a诱导THP-1细胞分化的过程,这需要进一步的实验来验证。用DR6抗体对MBP-S5a与膜蛋白的pull-down实验产物进行验证,通过Western Blot检测复合物中是否含有DR6,同时设MBP与膜蛋白的pull-down产物为对照,结果显示,只有MBP-S5a-膜蛋白实验组中出现了的阳性条带即存在DR6,说明S5a与膜蛋白DR6能够结合。为了证实S5a与DR6的相互作用,进一步采用Far-Western方法进行验证,结果显示,膜蛋白-S5a蛋白泳道在42kDa、90kDa、110kDa处有明显的杂交条带,结合之前的文献报道分析得出DR6翻译修饰后主要以p90和p110两种形式存在,所以结果得出的DR6分子量明显高于其理论分子量70 kDa,而42 kDa则是内源性的S5a, Far-Western检测结果与pull-down产物的Western检测结果一致,充分证明膜型的DR6能够与S5a相互作用。用激光共聚焦观察S5a与DR6蛋白共定位情况,结果表明,在THP-1细胞中,S5a与DR6在细胞表面共定位,说明DR6与S5a的相互作用发生在细胞膜表面。最后,通过Western Blot方法验证了重组S5a可以激活NF-κB通路。以上实验数据充分证明S5a与DR6能够相互作用,结合之前S5a诱导THP-1细胞分化的结论得出,S5a可能通过DR6诱导激活NFkB通路从而引起THP-1细胞分化。本课题在寻找与S5a相互作用的蛋白中,发现了重要的膜蛋白DR6,由于DR6的配体至今没有报道,这为确定其配体提供一个思路,即配体可能是个内源性的蛋白。通过深入研究S5a诱导单核细胞白血病细胞THP-1分化的机制,重点在发现了胞外S5a与细胞内外的DR6结合后,形成功能复合体,将生物信号传递至细胞内,激活NF-κB途径,从而引发细胞分化,这将为胞外信号触发的细胞分化研究提供基础资料,所得到的DR6很可能是白血病生物治疗在诱导细胞分化方向上新的靶点,这将为肿瘤生物治疗在肿瘤细胞诱导分化方向上开辟新的研究领域。