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葡萄糖氧化还原酶是一类催化葡萄糖氧化还原反应的酶,被开发用于传感器或检测试剂盒。葡萄糖氧化酶被广泛应用于血糖指标的临床生化检测。近些年发现葡萄糖脱氢酶具有替代葡萄糖氧化酶的应用潜力,因其不以氧气为电子受体,不受溶解氧的限制,检测结果误差更小。以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH,EC1.1.5.9),辅基结合紧密,催化效率高,可作为替代目前诊断用葡萄糖氧化酶的首选。这类葡萄糖脱氢酶主要来源于丝状真菌,罕见于细菌,重组表达和纯化较为困难。本研究选取细菌源Burkholderia cepacia的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)作为研究对象,主要涉及FAD-GDH在Escherichia.coli中异源表达,发酵调控,纯化工艺,酶学性质研究以及尝试在Bacillus.subtilis WB600中的分泌表达。主要内容如下:1.将gdh基因转入E.coli BL21(DE3),利用IPTG为诱导剂,通过上清酶活测定及SDS-PAGE电泳图谱分析,酶可溶性表达。利用乳糖替代IPTG作为诱导剂,摇瓶水平初步探索诱导条件,在7.5 L发酵罐放大培养,采用梯度流加补料,分阶段温度控制,酶活达到22200 U·L-1,菌体量达69.48 g·L-1。2.粗酶液通过镍柱,脱盐柱,阴离子交换柱三步层析获得纯酶FAD-GDH,比酶活109 U·mg-1,分子量约60 kDa。等电聚焦电泳检测酶的等电点pI为5.3。酶标仪全波长扫描吸收光谱确证该酶的辅基为FAD。相比其它糖类底物,以葡萄糖为底物的Km最小,为2.56 mmol·L-1,kcat/Km为3487.7 mmol·L-1·s-1。该酶pH稳定范围5.5-8.0,最适反应pH 7.0,当pH高于8.0时酶迅速失活,差式扫描量热分析(DSC)显示酶半解折叠温度(Tm)为77°C,热稳定性良好。3.以蛋白酶缺陷型菌株B.subtilis WB600为宿主进行FAD-GDH表达尝试,并采用启动子串联改造,信号肽替换,信号肽与启动子组合策略考察产酶情况。1)将4种启动子(PamyQ’,P43,PgsiB,Popuaa)分别与质粒上自带的启动子PHpaⅡ串联,结果表明PHpaⅡ-PamyQ’串联使FAD-GDH的胞内酶活最高,为2497 U·L-1。在此基础上删去PamyQ’启动子中cre位点,胞内酶活提高至3626 U·L-1,基因改造减少了碳代谢产物对启动子转录的抑制。2)分别利用三种双精氨酸信号肽(LipA,phoD,YwbN)替换FAD-GDH自身信号肽,YwbN信号肽有利于酶的分泌表达,胞外酶活/总酶活为22%。3)将最佳的双启动子PHpaⅡ-PamyQ2和信号肽YwbN组合构建重组菌WB18,胞外酶活/总酶活为24%。