燕麦β-葡聚糖的分子链结构及其体外活性

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燕麦β-葡聚糖是一种优质的水溶性膳食纤维,可以在水中形成粘稠的溶液而具有降血脂和降低餐后血糖等生理活性。本研究采用了一种新的提取方法-冷冻凝胶法得到了较高纯度的燕麦β-葡聚糖,并利用凝胶渗透色谱(GPC)、气相色谱(GC)、傅立叶变换红外光谱(FTIR)和核磁共振(NMR)等技术分析了燕麦β-葡聚糖的分子结构,还借助于原子力显微镜(AFM)和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)等新技术研究了燕麦β-葡聚糖的溶液行为。荧光探针Calcofluor可用来测定谷物和食品中β-葡聚糖的含量,利用紫外光谱法研究了Calcofluor和β-葡聚糖之间的相互作用力。从体外实验讨论了燕麦β-葡聚糖降血糖的可能原因,通过体外消化法研究了燕麦β-葡聚糖对食物中碳水化合物消化速率的影响,以及燕麦β-葡聚糖对α-淀粉酶活性的抑制作用。鉴于燕麦β-葡聚糖主要在肠道中发挥其生理作用,利用Caco-2细胞模型模拟肠道上皮细胞,尝试探讨了肠道细胞是否能吸收燕麦β-葡聚糖。主要研究内容和结果如下:   1、利用冷冻凝胶原理,提出了冻融凝胶制备燕麦β-葡聚糖新方法,其最佳条件为:提取溶剂为水,料液比1:10,提取温度60℃,提取2次,每次提取1h,然后将提取液浓缩至其中的β-葡聚糖浓度约为1%,反复冻融3次,冷冻干燥。产品得率为1.4%,所得β-葡聚糖的纯度为85.6%。   2、纯化后的β-葡聚糖经GPC-LLS测定,其重均相对分子质量为1.52×105。将燕麦β-葡聚糖酸水解并衍生化之后用GC测定其单糖组成,结果表明该多糖仅含葡萄糖。IR图谱显示燕麦β-葡聚糖由β-D-吡喃型葡萄糖组成,由一维和二维NMR图谱完全解析了燕麦β-葡聚糖的结构,证实其中的D-吡喃型葡萄糖是由β-(1→3)和β-(1→4)糖苷键所连接,分子中存在连续的β-(1→4)糖苷键,而β-(1→3)糖苷键则以单个的状态出现,(1→4)/(1→3)键的比值大约为2.2。   3、利用AFM和LSCM,而不是高分子物理中常用的方法和技术,在不同尺度层面重点研究了燕麦β-葡聚糖的溶液行为和在水溶液中形成的聚集体,证实了燕麦β-葡聚糖樱状胶束结构的存在。经AFM观察,随着浓度逐渐由10μg/mL上升至100μg/mL,燕麦β-葡聚糖逐渐由直径20-50nm,截面高度3-5nm的圆形聚集体转变成截面高度为20nm,宽度为300nm,长达3μm的纤维状结构,体现了浓度效应引起的多糖自组装过程,并显示出一临界浓度(100μg/mL),当低于此浓度时,多糖聚集体随着浓度增加而变大,当浓度高于其临界值时,自组装聚集体则由原来的圆球形变为了纤维状;而随着存放时间的延长,10μg/mL燕麦μ-葡聚糖也可以自发的在溶液中形成扁平的盘状聚集体结构,存放9天后这些圆盘状聚集体的直径约为300nm,高度介于15-20nm之间,可见,时间效应也使聚集体增大;而向Calcofluor中加入β-葡聚糖时,颗粒的高度由6-20nm增加至50-100nm。   利用荧光分子Calcofluor可以与燕麦β-葡聚糖特异性结合的性质,通过LSCM在较大的尺度上观察了燕麦β-葡聚糖溶液经过冷冻和解冻之后形成的纤维状聚集体结构,并观察到Calcofluor的荧光强度随着体系中燕麦β-葡聚糖浓度的上升而增加。   4、利用表面活性剂SDS将燕麦β-葡聚糖分散成了单个的分子,经AFM测量,这些单分子的平均直径约为0.44nm,数均轮廓长度(Ln)和均方根末端距(<Ree2>1/2)分别为938和912nm,计算得到的持续长度(Lp)为526nm。以上数据与文献中的光散射结果比较,二者十分接近,证实了AFM观测到的确实是单个的β-葡聚糖分子。同时也直观的证实了前人提出的β-葡聚糖是一种无分支的线性多糖链。   5、利用紫外光谱法研究了燕麦β-葡聚糖与Calcofluor的分子间相互作用。测定了两者在不同溶液环境中的结合常数(K),每个葡聚糖分子上的结合位点总数(N)以及平均每个葡聚糖分子上结合的Calcofluor分子数(n)。测定结果表明两者的结合同时受到焓和熵的驱动,同时证实了在两者的结合过程中,疏水相互作用是除氢键和范德华力之外的一种有意义的相互作用。燕麦β-葡聚糖是一种同时具有亲水和疏水特性的多糖。吸附等温线与Langmuir模型符合得很好。   6、燕麦β-葡聚糖的状态与其降血糖活性密切相关,固体状态的β-葡聚糖不能延缓体外消化模型中碳水化合物的消化,而呈液体状态的样品则可以明显延缓这一消化过程,加入液态β-葡聚糖溶液后,标准食物白面包中淀粉的消化率降低为空白组的88.8%,而相应的血糖指数也降低为88.5。而燕麦β-葡聚糖溶液对馒头中碳水化合物的消化也表现出类似的作用。这种延缓消化作用可以解释为燕麦β-葡聚糖溶液的粘性所发挥的生理作用,使之能够阻止α-淀粉酶与底物的结合,从而延缓酶解过程,但并非特异性反应。   7、燕麦β-葡聚糖溶液的不同添加方式对α-淀粉酶的活性具有不同的抑制效果。将浓度为1.25%的燕麦β-葡聚糖预先与可溶性淀粉混合后其抑制效果最好,抑制率为32.2%;直接添加β-葡聚糖抑制效果次之,抑制率为26.8%;预先将燕麦β-葡聚糖与α-淀粉酶混合其抑制效果最差,抑制率为17.7%。说明燕麦β-葡聚糖并不是一种酶抑制剂,而主要依靠其形成的粘性溶液来延缓酶的作用。   8、以Caco-2细胞作为肠道上皮细胞模型,与FITC标记的燕麦β-葡聚糖共培养后,利用荧光显微镜观察细胞对β-葡聚糖的吸收情况。结果表明,燕麦β-葡聚糖很难被肠道上皮细胞吸收,但是可以吸附于细胞表面,且吸附能力也不强。
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