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微小RNA (microRNA, miRNA)是一类功能高度保守的非编码单链小分子RNA,通过与靶基因mRNA的互补配对从而在转录或转录后水平对多个靶mRNAs的表达进行负调控。近年来研究表明,miRNA与发育、衰老、免疫和肿瘤等病理生理过程密切相关。在大鼠和线虫microRNA芯片的研究中发现miR-34随增龄表达上调,体外研究也证实miR-34能通过调控细胞周期等途径加速细胞衰老的进程。自噬是细胞通过溶酶体对自身受损结构的吞噬降解过程,对自噬作用的调控是p53、SIRT1等衰老相关基因调控寿命的关键环节。已有研究显示miR-34参与p53和SIRT1的信号通路,提示自噬可能是miR-34参与衰老调控的重要机制。本研究旨在通过体内外实验阐明miR-34在衰老进程中的确切作用及自噬在介导miR-34调控衰老作用中的分子机制。全文共分三个部分：第一部分：miR-34对线虫寿命的影响通过real-time RT-PCR检测大鼠和线虫miR-34随增龄的表达变化特点；并观察miR-34缺失突变对线虫寿命及应激耐受性的影响。结果发现：与3月龄大鼠相比,24月龄wistar大鼠心脏、脑组织、肝脏、胸主动脉和肾脏miR-34a的表达分别增高2.36、1.71、1.85、3.45和2.14倍(p<0.05-0.01)。与1d线虫成虫相比,7d、9d和13d野生型N2株线虫成虫miR-34的表达显著增高(p<0.05-0.01)。相关分析显示,N2株线虫miR-34的表达与增龄呈显著正相关(r=0.856, p<0.0001).线虫寿命分析结果显示,miR-34缺失突变能延缓线虫的衰老进程,使线虫寿命延长42%-62%(p<0.0001),并能改善线虫对热休克和氧化应激的耐受性。同时发现,间断禁食能使野生型N2株线虫寿命延长37%(p<0.0001),但不影响miR-34缺失突变株线虫的寿命。本部分研究结果显示,miR-34能够调控线虫的衰老进程,并提示其机制可能与限食、应激等共同的机制--自噬作用有关。第二部分：自噬在介导miR-34调控衰老中的作用研究利用RNAi敲除自噬相关基因,观察抑制自噬对miR-34缺失突变株线虫寿命的影响；并通过体外实验检测miR-34a(人miR-34主要转录本之一)对自噬的调控作用及SIRT1对该作用的影响。结果发现：在野生型N2株线虫,自噬基因RNAi组和对照质粒组之间的寿命无显著差异；而miR-34缺失突变株线虫各RNAi组的寿命较对照质粒组显著缩短(p<0.0001)。体外实验显示,miR-34a能抑制细胞自噬体标志物LC3II的表达(p<0.05)。与对照组相比,SIRT1 siRNA组LC3II的表达显著下调(p<0.05),但SIRT1 siRNA和miR-34a inhibitor共转染组LC3II的表达仍显著升高(p<0.05)。本部分研究结果揭示,miR-34通过抑制细胞的自噬作用而调控衰老,且该作用不完全依赖SIRT1,提示自噬是miR-34调控衰老的重要机制。第三部分：miR-34通过Atg4B和Atg9A调控自噬的机制研究利用生物信息学软件预测miR-34a可能的靶基因；通过体外实验验证miR-34a对靶基因表达的影响；进一步采用双荧光素酶报告基因系统检测miR-34a与靶基因3’-UTR序列的相互作用。结果发现：miR-34a共有2904个可能的靶基因,其中Atg4B和Atg9A直接参与自噬体的形成过程。体外实验显示,miR-34a能下调Atg4B和Atg9A蛋白的表达(p<0.05-0.01),但不影响其mRNA的表达水平。双荧光素酶检测结果显示,miR-34a能通过与Atg4B和Atg9A基因3’-UTR序列靶结合位点的相互作用,下调荧光素酶活性(p<0.05-0.01)。本部分研究结果证实,miR-34a能够在转录后水平直接抑制Atg4B和Atg9A蛋白的表达,从而调控自噬作用。综上所述,本研究从整体动物水平验证了miR-34能够促进衰老进程,而自噬是介导miR-34调控衰老作用的关键环节。并通过体外实验证实,miR-34a能够在转录后水平直接抑制自噬相关蛋白Atg4B和Atg9A的表达,进而调控自噬作用。