狂犬病病毒(Rabies virus，RV)是引起所有温血动物和人感染狂犬病的唯一病原体。大量研究表明该病毒的基因可在体外进行修饰、改造，并能对重组病毒进行拯救，从而为新型RV弱毒疫苗的研究奠定基础。病毒能否成功拯救，关键在于全长感染性cDNA克隆的构建。目前，全长感染性cDNA的构建多采用分步酶切连接，并利用脂质体转染至真核细胞的方法，操作过程繁琐和拯救效率低等缺点限制了新型RV弱毒疫苗的研制。本研究将HamRz和HdvRz序列合成到PCR引物中，利用PCR扩增将核酶序列添加到全基因组3端5端，按照Gibson Assembly连接方法的要求，设计带有一小段重叠序列的引物，扩增得到带有重叠序列的SRV9株各结构蛋白基因。首先应用Gibson Assembly连接法将6545 bp的大转录蛋白(large protein，L)基因分三段，一步组装至pcDNA3.1+载体，构建重组质粒pcDNA3.1-L，并在L基因前预留NheⅠ酶切位点，然后将纯化后的，带有重叠序列的RV其它结构蛋白基因，组装至NheⅠ限制性内切酶线性化后的重组质粒pcDNA3.1-L上，获得缺失Ψ区的SRV9株全长基组感染性cDNA(pcDNA-HamRz-NPMGL-HdvRz)。　　采用电穿孔技术将缺失Ψ区的全长感染性cDNA和辅助表达质粒共转染幼年叙利亚仓鼠肾细胞（Baby Hamster Syrian kidney-21，BHK-21），拯救缺失Ψ区的狂犬病病毒。通过RT-PCR、间接免疫荧光、Western-blotting和电镜观察等方法鉴定缺失Ψ区的狂犬病病毒SRV9株。　　实验结果表明，(1)经鉴定成功构建缺失Ψ区的狂犬病病毒SRV9株感染性cDNA克隆;(2)经证实与辅助表达质粒共转染BHK-21细胞，拯救获得了缺失Ψ区的狂犬病病毒SRV9株;(3)经酶切、RT-PCR、间接免疫荧光和Western-blotting检测的结果均表明拯救毒株能与狂犬病阳性血清发生特异性结合，拯救毒株G蛋白具有较好的抗原特性;(4)在电子显微镜下观察发现所拯救毒株具有典型的弹状病毒颗粒形态。　　Ψ区缺失株狂犬病病毒SRV9的拯救为进一步致弱狂犬病病毒毒力、构建狂犬病毒载体以及新型弱毒多联狂犬病疫苗的研究奠定基础。