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缺氧缺血性脑病(HIE)是新生儿窒息最严重的并发症之一,存活的重度HIE患儿常遗留神经系统远期后遗症。但迄今为止,HIE仍缺乏有效的治疗手段,因此,进一步明确HIE的发病机制并进行针对性的干预已成为其防治的关键。随着研究的逐渐深入,小胶质细胞炎性活化所介导的炎症反应已被证实为缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的重要机制之一,并在未来可能成为HIBD干预的重要靶标之一,但目前小胶质细胞炎性活化的机制尚不十分明确。焦亡是一种伴随着炎症反应的新的细胞程序性死亡方式,兼具坏死和凋亡的双重形态特征。NLRP-3炎性小体既是小胶质细胞炎性活化的重要上游,也是介导经典途径焦亡的关键组分,提示焦亡可能与小胶质细胞的炎性活化相关。因此,本课题拟通过模式动物及离体实验结合临床研究对NLRP-3/caspase-1/GSDMD信号轴介导的小胶质细胞焦亡在HIBD小胶质细胞炎性活化中的作用进行深入探讨。第一部分 NLRP-3介导的焦亡在HIBD新生大鼠小胶质细胞炎性活化中的作用目的:初步探讨NLRP-3介导的焦亡在HIBD小胶质细胞早期及持续炎性活化中的作用。方法:7日龄新生大鼠建立HIBD模型,采用qRT-PCR法及Western Blot(WB)法检测模型建立后0h、2h、6h、12h及24h脑皮层中焦亡调控分子NLRP-3、caspase-1、GSDMD及IL-1β的表达情况,了解HIBD早期脑皮层中的细胞焦亡水平。利用NLRP-3/caspase-1/GSDMD信号轴的关键上游分子NLRP-3的特异性抑制剂MCC950对大鼠HIBD模型进行干预并予qRT-PCR法及WB法检测模型建立后24h上述焦亡调控分子及小胶质细胞炎性活化标记分子CD68的表达改变情况,同时采用TTC染色法、HE染色法及电镜法检测脑皮层的组织损伤情况及小胶质细胞焦亡、小胶质细胞活化的情况,初步探讨NLRP-3介导的焦亡在HIBD早期小胶质细胞炎性活化中的作用。采用WB法检测HIBD大鼠1月龄时脑皮层中焦亡调控分子及小胶质细胞炎性活化标记分子CD68的表达情况,明确焦亡与HIBD中小胶质细胞持续炎性活化的相关性。结果:新生大鼠HIBD后早期(0h起)脑皮层中焦亡调控分子NLRP-3、caspase-1、GSDMD及IL-1β的表达即较对照组发生了上调。HIBD后24h组织形态学(TTC染色、HE染色及电镜法)观察发现脑皮层中明显的组织损伤伴有小胶质细胞焦亡及活化表现;MCC950干预后上述焦亡调控分子及小胶质细胞炎性活化标志分子CD68在mRNA及蛋白水平的表达均较HIBD组下调,伴有脑皮层组织损伤程度的减轻及小胶质细胞焦亡、活化水平的下降。至1月龄时HIBD组上述焦亡调控分子及小胶质细胞炎性活化标志分子CD68在蛋白水平的表达仍较对照组高,MCC950干预后上述分子的表达水平较HIBD组下调。结论:NLRP-3介导的焦亡与HIBD中小胶质细胞的早期及持续炎性活化相关,抑制焦亡的关键上游分子NLRP-3可起到抑制小胶质细胞炎性活化的作用。第二部分 NLRP-3/caspase-1/GSDMD信号轴介导的小胶质细胞焦亡在HIBD小胶质细胞炎性活化中的作用机制研究目的:深入探讨NLRP-3/caspase-1/GSDMD信号轴介导的焦亡在HIBD小胶质细胞炎性活化中的作用及其机制。方法:大鼠HAPI小胶质细胞系建立糖-氧剥夺(OGD)模型,采用WB法检测模型建立后 0h、2h、6h、12h 及 24h 焦亡调控分子 NLRP-3、caspase-1、GSDMD、IL-1β及小胶质细胞炎性活化标志分子CD68的表达情况,并利用倒置显微镜及电镜观察小胶质细胞的损伤情况及其焦亡、活化水平。分别利用NLRP-3过表达、NLRP-3干扰及GSDMD干扰慢病毒转染大鼠小胶质细胞并建立OGD模型,于模型建立后24h再次检测不同转染组中焦亡调控分子NLRP-3、caspase-1、GSDMD、IL-1β及小胶质细胞炎性活化标志分子CD68的表达情况,并通过LDH检测联合电镜法综合评估小胶质细胞的焦亡水平。结果:在OGD损伤早期(0h/2h起)大鼠小胶质细胞系中焦亡调控分子NLRP-3、caspase-1、GSDMD、IL-1β及小胶质细胞炎性活化标志分子CD68在蛋白水平的表达即较对照组发生了上调,同时伴有形态学上小胶质细胞的焦亡及周围小胶质细胞活化的表现。NLRP-3过表达的小胶质细胞OGD模型中上述分子在mRNA或蛋白水平的表达较空病毒转染的OGD组上调,伴有LDH检测联合电镜提示的小胶质细胞焦亡水平的升高及周围小胶质细胞活化程度的加重;而经NLRP-3沉默及GSDMD沉默后的小胶质细胞OGD模型中上述分子的表达水平较空病毒转染OGD组下调,伴细胞焦亡、活化程度的减轻。结论:HIBD后小胶质细胞可通过NLRP-3/caspase-1/GSDMD信号轴介导的经典途径焦亡,释放大量炎症因子进而促进其周边小胶质细胞迅速、大量炎性活化进而导致脑损伤。抑制该途径的焦亡可作为HIBD后脑损伤干预的新靶标。第三部分 HIE新生儿外周血中的焦亡水平与缺氧缺血严重程度的相关性目的:初步探讨HIE新生儿生后早期外周血中NLRP-3/caspase-1/GSDMD信号轴介导的焦亡水平对缺氧缺血损伤严重程度的提示作用。方法:采用qRT-PCR法检测HIE新生儿及同时期出生的相近胎龄的正常足月新生儿生后72h内外周血中焦亡调控分子的表达水平并分析其与患儿缺氧缺血严重程度(以生后5min Apgar评分表示)的相关性。结果:HIE新生儿生后72h内其外周血中焦亡调控分子NLRP-3、caspase-1、GSDMD、IL-1β在mRNA水平的表达即已发生上调,且上述分子的mRNA水平与患儿缺氧缺血损伤的严重程度呈正相关。结论:HIE患儿生后早期外周血中焦亡调控分子的表达即升高且其表达水平与缺氧缺血的严重程度呈正相关。总 结1.模式动物及离体实验研究提示HIBD后小胶质细胞可通过NLRP-3/caspase-1/GSDMD信号轴介导的经典途径焦亡,释放大量炎症因子进而促进其周边小胶质细胞迅速、大量、持续地炎性活化进而导致HIBD后早期及持续脑损伤。2.抑制NLRP-3/caspase-1/GSDMD信号轴介导的经典途径焦亡可作为HIBD后早期及持续脑损伤干预的新靶标。3.临床研究也证实HIE患儿生后早期外周血中焦亡调控分子的表达即升高且其表达水平与缺氧缺血的严重程度呈正相关。