研究背景：由遗传基因突变参与的凝血机制异常,有研究认为遗传基因突变多于30%的个体参与了深静脉血栓的发生发展过程。对这类基因多态现象的研究已经成为热点,特别是与人类血管性常见疾病——深静脉血栓之间的关联性已做了相当深入的研究：发现越来越多的基因多态现象参与了凝血机制的调节,并与静脉血栓的形成构成相关性。近年来已有报道PECAM-1基因与动物小鼠DVT的关系研究,并得出其与血栓严重程度相关的研究结果。血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1)已确定11个单核苷酸多态性(SNP),目前PECAM-1基因只有3个SNP被发现与疾病有关,即Leul25Val, Asn563Ser,ly670Arg。为了进一步探索PECAM-1基因与临床深静脉血栓患者的相关性,我们从基因水平研究了其多态现象对静脉血栓易感性的影响(第一部分)；同时借助动物实验,进一步探索了PECAM-1在协助气体信号分子H2S抗血栓形成中的作用机制(第二部分)。本课题以临床病例为基础,利用动物实验的特别优势,采用可靠的试验方法对血栓的发生发展涉及到的PECAM-1分子机制进行了深入探讨,以期得到一些对深静脉血栓诊治具有更多帮助的研究成果,而这方面的研究目前国内外尚未见报道。通过文献检索,PECAM-1基因Leul25Val多态性多有报道与动脉粥样硬化性疾病如冠心病、心肌梗死相关性的研究文章,但研究结果并不一致,为了从循证医学(EBM)的角度明确PECAM-1基因Leul25Val多态性与某些血管性疾病是否具有关联关系,我们对此进行了荟萃分析(第三部分),作为文献综述的补充,以期进一步了解该基因与临床已知易感疾病的范围。第一部分PECAM-1基因Leu125Val多态性对深静脉血栓易感性影响的研究深静脉血栓(DVT)和肺栓塞(PE)又称静脉血栓栓塞症(VTE)。深静脉血栓和肺栓塞被认为是同一疾病的两个不同阶段。深静脉血栓是一种临床常见疾病,年发病率在千分之一以上。下肢深静脉血栓如不能得到及时有效的治疗,常会演变为深静脉血栓后综合征(PTS),严重影响患者生活质量。DVT被认为是遗传、环境及行为活动共同作用的结果。有研究表明,血小板在内皮细胞的黏附是启动和促进静脉血栓形成的关键环节。当血管内膜损伤时,血小板通过快速聚集和黏附在损伤部位使受伤内膜得以修复。目前关于细胞粘附分子与深静脉血栓形成的关系机制尚未完全了解,细胞粘附分子特别是血小板内皮细胞粘附分子-1的作用正成为研究热点。PECAM-1是分子量达130-kDa的细胞表面糖蛋白,又名CD31,属于细胞粘附分子免疫球蛋白超家族成员。PECAM-1主要功能是介导内皮细胞间及细胞与细胞外基质间的黏附；介导内皮细胞与白细胞间的黏附；介导细胞内外的信号转导、血管炎症反应以及白细胞跨内皮迁移,并与其它黏附因子之间发生受体配体反应,继而对血小板的聚集、活化与释放功能,对原发或继发血栓的形成和发展产生影响。有实验表明,PECAM-1基因敲除小鼠DVT模型显示出更大的血栓和更长的血栓消退时间,具有更高水平的血浆sPECAM-1者则出现血栓溶解的明显延迟。目的与方法本研究通过病例-对照设计,采用聚合酶链反应—限制性片断多态性技术同时检测了PECAM-1Leul25Val、Asn563Ser、Gly670Arg三个多态位点的组间分布,用酶联免疫吸附方法测定相应个体血浆sPECAM-1水平。结合彩超检查评分首次探讨了sPECAM-1三种基因特别是基因型Leul25Val多态性位点及其血浆sPECAM-1水平与深静脉血栓发生发展的关系,目的探索预测和防治DVT的新方法,为DVT高危个体的早期筛查提供新的遗传标记。结果通过研究分析DVT组和对照组PECAM-1Leul25Val, Asn563Ser,及Gly670Arg基因频率和等位基因频率,DVT组多态性位点Leul25Val基因型Leu/Leu、Leu/Val、Val/Val频率分别为12.2%、47.8%、40.0%,等位基因频率Leu、Val分别为36.1%、63.9%；对照组相应基因型频率为24.0%,53.9%,22.1%,相应等位基因频率为51.0%、49.0%；方差分析表明Leul25Val基因型频率与等位基因频率的多态性比较有显著不同(P<0.01)；DVT组Leul25Val基因型及等位基因明显高于对照组(X2=10.25, P<0.01; X2=9.85, P<0.01)。同时,进一步研究发现与基因型Leu/Leu比较,基因型Val/Val与DVT的风险增加相关最为明显(OR=3.57;95%CI,2.47-5.16, P=0.008)。而多态性位点Asn563Ser和Gly670Arg基因型频率及等位基因频率显示在DVT组与对照组之间则无统计学意义(P>0.05)。提示PECAM-1多态位点Leul25Val基因型特别是Val/Val与DVT患病风险具有明显关联性。通过ELISA法检测DVT组和对照组患者血浆sPECAM-1水平,发现DVT组血浆sPECAM-1水平(83.4±23.5ng/m1)明显高于对照组(60.4±19.4ng/m1)(P<0.01)。进一步分析两组Leul25Val基因型Leu/Leu、Leu/Val和Val/Val的血浆sPECAM-1水平,单因素方差分析显示,DVT组Leul25Val基因型纯合子Val/Val的血浆sPECAM-1水平及其杂合子Leu/Val血浆sPECAM-1水平显著高于基因型纯合子Leu/Leu血浆sPECAM-1水平(p<0.01)。而两组Val/Val基因型血浆sPECAM-1水平也分别高于同组Leu/Val基因型血浆sPECAM-1水平(p<0.05)。彩超压缩试验评估患者在诊治初期及治疗后28天血栓负荷,显示Leul25Val基因型纯合子Val/Val的血栓基线得分明显高于Leu/Leu与Leu/Val基因型。DVT患者治疗28天后,Leu/Val与Val/Val基因型⊿血栓分数(血栓分数基线-第28天的血栓分数)明显低于Leu/Leu基因型,这能进一步说明等位基因Val可能引起了DVT患者血栓的延迟溶解。结论PECAM-1Leul25Val基因型Leu/Leu、Leu/Val和Val/Val与DVT患病风险具有关联性(p<0.05)。与等位基因125Leu比较,等位基因125Val与DVT的风险增加相关性更明显(p<0.01)。DVT患者组比健康人群具有更高的血浆sPECAM-1水平,而且Leu/Val及Val/Val基因型还表现出了血栓负荷的增加及血栓溶解的延迟。因此推断,PECAM-1基因多态性位点Leul25Val可能是DVT发生发展的关键影响因素之一。第二部分PECAM-1基因参与H2S抗血栓作用的实验机制研究深静脉血栓形成(DVT)是由于细胞黏附分子介导的炎症细胞聚集并黏附于血管内皮,继而激活血小板聚集引起的。血小板在内皮细胞的黏附依赖于血小板与单核细胞、中性粒细胞之间的相互作用,作为促进静脉血栓形成的关键环节,这些相互作用常依赖于众多细胞粘附分子的调控。血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1)是一种细胞表面糖蛋白(又名CD31),又是一种具有众多生物学调控作用的信号分子。PECAM-1具有强烈的抑制血小板聚集并能引起抗血栓形成的作用；在内皮细胞中,PECAM-1还具有抗炎症反应的作用,而炎症反应则能促进血液的高凝及血管通透性的增强,导致血栓形成。实验证实,PECAM-1基因敲除小鼠显示出了更大的动静脉血栓和更长的血栓消退时间,表明了PECAM-1在抑制血栓形成中的重要地位。硫化氢(Hydrogen sulfide, H2S)也是一种具有广泛生理药理调控作用的气体信号分子。硫化氢同样具有抑制炎症反应、抑制血小板和血栓形成的作用。研究目的本研究通过体外血小板聚集功能试验和DVT小鼠模型旨在探索PECAM-1是否参与了硫化氢抗血小板聚集和血栓形成的作用。应用一氧化氮(nitric oxide,NO)合酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)探明这些作用是否依赖于一氧化氮信号通路；同时,为了研究硫化氢对PECAM-1的调控作用,通过小干扰RNA (Small interfering RNA, siRNA)的帮助,进一步探寻PECAM-1在硫化氢抗血小板聚集及血栓形成中所扮演的角色。这些实验研究可为提高血栓性疾病的临床诊治水平提供理论支持。实验方法1.血小板聚集实验对应用多板(Multiplate)阻抗集合度测定法(impedance aggregometry)实施血小板聚集实验。采集的人新鲜全血经洗涤、计数后,与硫化氢供体硫氢化钠(sodium hydrogensulfide, NaHS)在37℃孵育5分钟并不停搅拌。加入不同的诱导剂进行血小板聚集实验,如花生四烯酸(arachidonic acid, AA,0.5mmol/L),凝血酶受体活化肽(thrombin receptor-activating peptide, TRAP,32μmol/L),腺苷二磷酸(ADP,6.5μmol/L),或胶原(collagen,3.2μg/mL)。加NaHS的同时加入L-NAME (10μmol/L),观察NaHS的作用是否是一氧化氮依赖性的。2.流式细胞仪检测纤维蛋白原(fibrinogen)结合力NaHS处理的全血与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的纤维蛋白原抗体孵育20分钟,流式参数由FACSCalibur装置获取,数据采集自5000个细胞,由CellQuest专业软件(Version3.3; BD Biosciences)进行分析。3.动物血栓模型的建立60只C57BL/6小鼠随机分为3组,分别给予生理盐水(对照组),NaHS (10mmol/kg body weight), NaHS+L-NAME (100mg/kg body weight).用蚊式血管钳分三段各钳夹股静脉1次,每次持续3秒。造模后48小时后切开皮肤,观察股静脉血栓是否形成,严重程度以及是否消退。取出股静脉内的血栓并称重。切去股静脉及其属支,用生理盐水冲洗后置液氮冷冻。4. Western blot分析解冻的血管内皮或人全血用冷PBS缓冲液洗涤,裂解蛋白并定量,经10%SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜上。封闭后加入1：1000稀释的一抗(兔抗小鼠eNOS,iNOS和PEC AM-1抗体,小鼠抗人PEC AM-1和Phospho (Ser473) AKT抗体),β-actin作为内参照,室温孵育1h,经TBST洗涤后再加入相应的1：1000稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗小鼠IgG),室温孵育1h,洗涤后进行化学发光显色、曝光。胶片扫描后,经Image J图像分析软件进行灰度分析5.小干扰RNA(siRNA)针对PEC AM-1基因设计一个特异性的siRNA,应用脂质体转染HUVECs细胞。转染后48小时,Western blot分析PEC AM-1蛋白含量,观察基因抑制效果。6.血小板粘附活性试验人脐静脉内皮细胞HUVECs细胞用来研究经硫化氢处理的血小板的粘附能力。细胞接种于涂有明胶的盖玻片上,并生长铺满。经洗涤过的ADP活化的人血小板悬液滴于盖玻片并孵育。用PBS溶液洗去未结合的血小板,3.7%多聚甲醛固定后结晶紫染色,在光学显微镜下观察、拍照。视野下计数粘附有血小板的HUVECs细胞,并计算其与总HUVECs细胞数的比例。结果1.硫化氢抑制血小板功能NaHS能以浓度依赖方式,分别抑制由花生四烯酸,凝血酶受体活化肽,腺苷二磷酸和胶原诱导的血小板聚集。L-NAME能显著减弱NaHS对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用。NaHS能以浓度依赖方式降低ADP刺激的纤维蛋白原结合力。2.硫化氢显示抗血栓活性与对照组DVT小鼠相比相比,NaHS组的静脉血栓发展更慢,在钳夹后48小时血栓体积显著小于对照组。NaHS减小血栓体积的作用能被L-NAME部分减弱。与对照组相比,NaHS组显示更高的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达。同时给予L-NAME处理后,‘;NOS和iNOS蛋白表达显著降低,不仅低于NaHS组,也显著低于对照组。3.硫化氢增加血小板和内皮细胞PECAM-1表达NaHS能显著并以浓度依赖方式增加血小板PECAM-1蛋白表达。与对照组DVT小鼠相比,NaHS组显示更高的PECAM-1蛋白表达。同时给予L-NAME处理后,PECAM-1蛋白表达显著降低,但仍高于对照组。NaHS以浓度依赖方式抑制血小板Akt磷酸化(Ser473)。4. PECAM-1参与硫化氢抗血栓作用应用小干扰RNA (siRNA)技术抑制HUVECs细胞中PECAM-1表达。转染siRNA-PECAM-1的HUVECs细胞分别与未活化血小板,ADP活化血小板以及ADP活化血小板+NaHS处理1小时。结果显示,ADP能显著增加HUVECs细胞与血小板的粘附活性,siRNA-PECAM-1能显著增加各组HUVECs细胞的血小板粘附活性,减弱硫化氢的血小板抑制功能。结论硫化氢具有体外抗血小板聚集和体内抑制血栓形成的作用,其机制可能与增强了eNOS和iNOS的表达,继而最终增强了PECAM-1蛋白表达有关。PECAM-1蛋白参与了硫化氢抑制血小板及抗血栓功能,是硫化氢下游的作用靶点之一。研究提示在血栓的发生发展中可能存在有H2S-NO-PECAM-1信号通路,这个通路能很好的解释机体抗血栓作用的机制。第三部分PECAM-1基因Leu125Val多态性与动脉硬化性疾病(冠心病)关联荟萃分析目前,炎症在动脉粥样硬化性疾病的发生发展中所起的重要作用已被大家所认知。血小板活化、聚集和血栓的形成被认为是动脉粥样硬化性疾病发病过程中的关键因素。血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1),主要表达于血液循环中的血小板,中性粒细胞,单核细胞、特异性T细胞和内皮细胞的表面,血小板内皮细胞粘附分子-1基因有3个多态位点已被发现与疾病有关,PECAM-1基因及其受体基因作为研究动脉硬化的候选基因,一直被国内外学者所广泛关注。其中,PECAM-1调控区Leul25Val(C373G, rs668)基因单核苷酸多态性(SNP)与动脉粥样硬化性疾病特别是冠动脉粥样硬化性心脏病的关联关系正成为临床研究热点。流行病学资料表明,心脑血管疾病的发病率、死亡率呈逐年上升趋势。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是导致心脑血管疾病的主要原因。到目前为止已有多项研究探讨了PECAM-1基因Leul25Val多态性与冠心病的关系,但是研究结果缺乏一致性。鉴于已经发表文章的结论差异,我们进行这项荟萃分析旨在进一步探讨血小板内皮细胞粘附分子-1基因多态性Leul25Val (C373G)多态性与动脉硬化性疾病之间易感性的关系。本文对已公开发表的所有中英文PECAM-1基因Leul25Val (C373G)多态与动脉硬化性疾病的关联研究进行检索,通过筛选并归纳总结,查找目前已经发表的病例对照分组或队列研究,严格制定文献纳入标准,认真评估纳入文献质量,汇总后对其进行签萃分析,以期探寻PECAM-1基因多态性Leul25Val与动脉硬化性疾病发病风险的相关性；为进一步研究血管性疾病或其他类似疾病提供依据。研究目的对PECAM-1基因Leul25Val多态性与动脉硬化性疾病,特别是冠心病关系的研究结果进行综合定量评价,以期获得该基因多态性与动脉硬化性疾病发病风险之间的可靠证据。研究方法通过检索PubMed,EMBASE和万方数据库,入选2011年1月以前在公开刊物上发表的病例对照研究或队列研究作为荟萃分析的数据来源。各研究间进行一致性检验,从符合条件的研究中提取数据进行荟萃分析。使用合并比值比(OR)和95%置信区间(95%CI)来评估疾病风险和血小板内皮细胞黏附分子-1遗传多态性(Leul25Val)之间的关联。用Review Manager软件(5.2版)进行荟萃分析。发表偏倚用漏斗图检测。结果共检索到102篇文献,包括中文66篇中文文献,36篇英文文献进行荟萃分析,有2篇为颈动脉硬化性脑梗死相关研究,未见有下肢动脉硬化闭塞症的相关研究。最终有15篇文献符合纳入荟萃分析标准,且均为冠状动脉硬化性心脏疾病方面的研究,共计7636例受试者,其中3696例是病人和3940例是健康对照。15个独立的研究均为Leul25Val(125C/G)多态性与冠心病易感性之间的关系。森林图显示了15个病例对照研究中血小板内皮细胞粘附分子-1基因多态性和冠心病之间关联性的荟萃分析研究结果。可以从这三个图中看出纳入研究的系统性回顾,其中包括一些病例数和健康对照组,权重、比值比及95%置信区间。显性遗传模式下(LL+LV)/VV的异质性检验显示Chi2=100.53,P<0.001,I2=86%;隐性遗传模式(VV+LV)/LL异质性检验显示Chi2=34.99,P=0.001,I2=60%:等位基因模式下V/L异质性检验显示Chi2=68.55,P<0,001,I2=80%.因它们的I2均大于50%,遂使用随机效应模型进一步分析：显性模型下(LL+LV)vsVV,OR=1.15,95%CI：0.84-1.56,P值=0.38；隐性模式下(VV+LV)vsLL,OR=0.96,95%CI：0.79-1.17,P值=0.69；等位基因模式下V vs L,OR=1.08,95%CI：0.92-1.27,P值=0.80。荟萃分析最终显示在三种模型中血小板内皮细胞粘附分子-1Leul25val多态性与动脉硬化性疾病(冠心病)风险未见关联性。结论通过我们的荟萃分析结果表明,血小板内皮细胞黏附分子-1基因Leul25val分子多态性并不是动脉硬化性疾病(冠心病)易感标记物。