格尔德霉素(geldanamycin，GDM)是一种苯醌型安莎类抗生素。吸水链霉菌(Streptomycin hygroscopicus)17997是本所科研人员从我国土壤中分离得到的GDM产生菌。GDM具有抗原虫、抗肿瘤作用，还具有良好的抗病毒活性。近年研究表明，GDM的这些生物学活性是由于它能特异性地结合热休克蛋白90(Hsp90)的ATP／ADP结合结构域，抑制其分子伴侣功能，从而下调多种靶蛋白(包括酪氨酸激酶、类固醇激素受体和转录因子等)的功能所致。GDM作为Hsp90的特异性抑制剂，可能成为新型的抗癌和抗病毒药物。但其水溶性差，肝毒性大，所以寻找其水溶性好且低毒的衍生物成为当今研究的主要目标。GDM衍生物17-烯丙胺基-17-去甲氧基GDM(17-AAG)和17-二甲基胺乙基-17-去甲氧基GDM(17-DMAG)目前正在美国进行Ⅱ期和Ⅰ期临床实验。 为了对GDM进行生物学的改造，首先必须获得其生物合成基因簇。GDM的生物合成与安莎类抗生素相似：它们以3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)为起始单位，由一个脂肪族的安莎链通过酰胺桥接作用连接在苯或萘发色团的非邻近位置而形成的。参与安莎链生物合成的酶基因属于I型PKS。本实验室利用AHBA合酶保守区，以及根据红霉素、竹桃霉素等I型PKS的酮基合成酶(KS)和酰基转移酶(AT)保守区设计简并引物，以其PCR产物作为探针，通过菌落杂交对吸水链霉菌17997基因文库进行筛选，分别获得了pCGBA10(简称COS1O)等15个阳性cosmids克隆和pCGBK10(简称pg10)等6个克隆。测序分析表明，cos10包含有约25 kb的外源片段，其中除含有参与GDM生物合成的AHBA基因簇之外，还包含有与I型PKS基因同源的约7.0kb片段，而pg10含有约30 kb与I型PKS基因同源的外源片段。 为了进一步研究基因簇COS10和pg10的功能，确认其是否参与GDM或其它次级代谢产物的生物合成。我们利用ET12567／pUZ8002介导的大肠杆菌-链霉菌基因接合转移系统，通过抗性筛选和PCR验证获得基因双交换阻断变株，对其发酵产物进行分离纯化，测定生物活性并鉴定结构。经HPLC检测发现cos10和pg10基因簇阻断变株的发酵产物依然含有GDM，而且在现有实验条件下也没有提示它们产生与吸水链霉菌17997原株明显不同的代谢产物，说明它们不直接参与GDM的生物合成。然而pg10阻断变株中GDM的产量比原株明显提高约2倍。用含pg10基因簇的变铅青链霉菌(S.lividans)TK24与GDM-PKS阻断变株共培养，HPLC可检测到少量GDM的产生。提示该PKS(pg10)介导的生物合成与GDM的生物合成可能有竞争关系，阻遏该基因簇的活性有利于聚酮体代谢流向GDM的合成。 同时，本论文还对GDM的后修饰基因——氨甲酰基转移酶基因(gdmN)阻断变株产生的GDM衍生物进行了研究，并证明该基因阻断后其阻断株可以产生4,5-二氢-7-去氨甲酰基GDM(CT-1-7)，这一结果与Hong K.S.等人的报道是一致的。然而，我们从该基因阻断变株中还发现一个新的化合物(CT-1-1)，经1H NMR、13CNMR和高分辨质谱等分析，并与GDM等已知化合物进行比较，证明新化合物(CT-1-1)为一个新的GDM衍生物——4,5-二氢-7-去氨甲酰基-19-O-甘氨酰GDM。发酵过程显示化合物CT-1-1可能是由和化合物CT-1-7衍生以及CT-1-1并不能从非酶催化的CT-1-7转化得到的实验结果提示，GDM C-19位O-甘氨酰化的修饰很有可能是由另一个或两个GDM后修饰酶催化形成的。虽然与GDM相比CT-1-1的抗肿瘤和抗病毒活性很弱，但是它的水溶性显著提高，这为下一步GDM结构修饰奠定了基础。 我们尝试在化合物CT-1-1的C-7位加上氨甲酰基以提高其生物活性。实验证实，化合物CT-1-1确实能够被具有有氨甲酰基转移酶活性的GDM-PKS变株及17997原株进一步生物转化，得到一个新化合物(CT-1-2)，通过结构解析证实，化合物CT-1-2的C-7位为氨甲酰基，C-19位保留O-甘氨酰取代，结构上更接近GDM。但是它的C-4,5位依然是二氢结构，与化合物CT-1-1相比其抗肿瘤细胞活性却没有明显的增强，这与我们通过虚拟分子模拟和预想的结果不相符。GDM C-19位修饰和C-4,5位二氢结构对其抗肿瘤细胞活性的影响还有待进一步研究。 本研究首次在GDM 17997氨甲酰基酶阻断变株中发现一条新的后修饰途径和两个新的GDM衍生物，即GDM C-19位的甘氨酰基化，形成CT-1-1和后者进一步的C-7位氨甲酰基化，形成CT-1-2。并证明GDM C-19位的甘氨酰基化后其水溶性明显提高。本论文对GDM生物合成后修饰的研究及生物和化学改造具有一定的理论与实际意义。 为了研究氨甲酰基转移酶的特性，我们将吸水链霉菌17997中gdmN基因进行了克隆和异源表达，纯化获得了氨甲酰基转移酶融合蛋白。 本研究最后以两个新化合物的结构为基础，提出化学和生物学方法结合对GDM进行结构改造的设想，为在GDM的C-7和C-19位进行改造，获得有生物活性的GDM衍生物提出研究方向。