目的:　　肝细胞肝癌(HCC)是原发于肝脏的恶性肿瘤，是全世界最常见的恶性肿瘤之一，是世界第三大致死性癌症。大部分患者在癌症晚期才被诊断出来，治疗方式有限，因此研究新的疾病标志物并阐明其作用机制将有助于发现疾病新的治疗方法，改善患者的预后，提高生存期。近年来，TRIM蛋白在癌症进展中的作用引起了很多研究者的关注，TRIM蛋白家族已经有多个成员被确认能够发挥对肿瘤的促进效应或抑制效应。TRIM50是TRIM家族的新成员，到目前为止，关于TRIM50功能的报道非常有限，TRIM50在癌症中的作用尚未明确。本课题深入研究了TRIM50在肝细胞肝癌进展中的作用效果，并探讨了其分子机制，为肝细胞肝癌的治疗提供新的思路。　　方法:　　1.检测TRIM50在肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织中的表达情况　　收集79对肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织用于免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）检测，52对配对的肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织进行蛋白印迹(Western blot)分析，并将51对肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织用于定量实时聚合酶链式反应(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)。检测TRIM50在肝癌组织中的表达水平，并进行统计分析。　　2.TRIM50对肝癌细胞生物学行为的影响　　2.1过表达TRIM50对肝癌细胞生物学行为的影响　　向BEL7402和HUH7肝癌细胞中转染TRIM50质粒，以空载体转染组作为对照，通过Western blot实验检测TRIM50蛋白水平表达情况。在肝癌细胞中成功过表达TRIM50后，通过CCK-8、克隆形成实验、transwell迁移和侵袭实验检测TRIM50对肝癌细胞增殖、克隆形成能力、迁移和侵袭能力的影响。　　2.2干扰TRIM50表达对肝癌细胞生物学行为的影响　　向HepG2细胞中转染TRIM50小干扰RNA(Si-TRIM50)，以无义序列转染组作为对照，继续培养细胞24h后收集蛋白样品，通过Western blot方法检测其对TRIM50的干扰效果，筛选出干扰效率显著的小干扰序列进行后续实验。成功构建TRIM50表达敲低的肝癌模型后，通过CCK-8、克隆形成实验、transwell迁移和侵袭实验检测TRIM50对肝癌细胞增殖、克隆形成能力、迁移和侵袭能力的影响。　　3.TRIM50对肝癌细胞抵抗失巢凋亡的影响　　4TRIM50对肝癌细胞作用效应的分子机制　　4.1检测TRIM50在肝癌细胞中的分子靶点　　4.2TRIM50对SNAIL的调控效应　　4.3检测TRIM50发挥作用的信号通路　　5裸鼠成瘤实验模型进一步验证TRIM50对肝细胞肝癌的抑癌效应　　5.1构建裸鼠成瘤实验模型　　5.2检测TRIM50对裸鼠成瘤的影响　　5.3动物体内实验验证TRIM50的分子靶点及机制　　结果:　　1.TRIM50在肝癌组织中表达下调，并抑制肝癌的进展　　1.1IHC结果表明，TRIM50在肝癌组织中低表达，并抑制肝癌的进展　　用IHC检测79对肝癌患者的肝癌组织及对应远端非癌肝组织中TRIM50的表达水平。实验结果显示，TRIM50在肝癌组织中的表达水平显著低于远端非癌肝组织。为了进一步研究TRIM50在肝细胞肝癌组织中的低表达是否与疾病进展相关，深入分析了TRIM50表达水平与疾病临床状态的关系。分析结果表明，低分化的肿瘤组织和发生转移肝癌患者的肿瘤组织中，TRIM50的表达水平显著低于高分化以及未发生转移的肿瘤组织。　　1.2Real-time PCR结果显示，TRIM50mRNA在肝癌组织中的表达水平显著降低　　为了进一步验证TRIM50在肝癌组织中的表达情况，用qRT-PCR方法检测了51例临床病人样本的TRIM50mRNA水平。实验结果表明，TRIM50mRNA在肝癌组织中的表达水平显著低于相应的远端非癌肝组织。　　1.3Western blot结果表明，TRIM50在肝癌组织中的表达水平显著降低　　收集52例临床肝细胞肝癌患者的肝癌组织标本及远端非癌肝组织标本，通过Western-blot方法检测TRIM50蛋白的表达情况。结果显示，TRIM50在肝癌组织中的表达水平显著低于对应的远端非癌肝组织。另外对临床资料分析显示，TRIM50在低分化的肿瘤、TNM分期晚期和发生转移的肿瘤中的表达水平显著降低。这些实验结果表明，TRIM50在肝癌组织中的表达水平显著下调，并且它的低表达可能参与了肝细胞肝癌的进展。　　2.TRIM50的外源性过表达显著抑制肝癌细胞的恶性行为　　3.TRIM50逆转肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应　　抵抗失巢凋亡是癌症的标志，也是肝癌细胞发生远处转移的先决条件。之前的实验结果表明肝癌细胞能够抵抗失巢凋亡，并且在此过程中获得更多的恶性行为。因此，通过构建失巢凋亡细胞模型，进一步研究了TRIM50对肝癌细胞抵抗失巢凋亡能力的影响。　　3.1TRIM50逆转肝癌细胞抵抗失巢凋亡的能力　　在本研究中，CCK-8实验表明，过表达TRIM50之后，失巢后的肝癌细胞活力显著被抑制，死亡细胞显著增多。进一步通过Western blot实验检测凋亡通路的效应分子，剪切型的Caspase-3(Cleaved Caspase-3，C-Caspase-3)的变化。实验结果显示，过表达TRIM50后，失巢后的肝癌细胞能够产生明显的凋亡现象。本研究结果提示，TRIM50能够逆转肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应。　　3.2TRIM50逆转失巢后肝癌细胞的克隆形成能力　　向肝癌细胞中转染TRIM50质粒，以空载体转染组作为对照，用克隆形成实验检测TRIM50对失巢后肝癌细胞克隆形成能力的影响。实验结果显示，与对照组相比，过表达TRIM50后，失巢后的肝癌细胞克隆形成能力显著被抑制。　　3.3TRIM50逆转失巢后肝癌细胞的侵袭能力　　向肝癌细胞中转染TRIM50质粒，以空载体转染组作为对照，用transwell实验检测TRIM50对失巢后肝癌细胞侵袭能力的影响。实验结果显示，与对照组相比较，过表达TRIM50后，失巢后肝癌细胞的侵袭能力显著降低。　　4TRIM50通过直接靶向降解SNAIL并逆转EMT发挥抑制肿瘤的效应　　4.1TRIM50蛋白直接与SNAIL蛋白相互作用　　4.2TRIM50通过RING结构域负向调控SNAIL的蛋白水平　　4.3TRIM50诱导K48位泛素化修饰SNAIL，促进SNAIL的降解作用　　4.4TRIM50抑制SNAIL介导的EMT过程　　SNAIL是一种转录因子，在调控EMT过程中发挥重要作用，并能进一步促进癌症的发生。因此，进一步研究了TRIM50是否通过抑制SNAIL介导的EMT过程来发挥抑制肿瘤的效应。IF结果显示，过表达TRIM50后，上皮细胞的标记物E-cadherin、β-catenin的荧光强度增强，而间质细胞的标记物N-cadherin、SNAIL的荧光强度减弱。同时Western blot结果显示，过表达TRIM50后，E-cadherin表达上调，而Vimentin、SNAIL的表达下调;干扰TRIM50后，E-cadherin表达下调，而Vimentin、SNAIL表达上调。这些结果提示，TRIM50通过负向调控SNAIL，发挥对EMT的抑制效应。　　4.5TRIM50通过直接靶向降解SNAIL而发挥其抗肿瘤作用　　在肝癌细胞中共转TRIM50质粒和SNAIL质粒，并以空载体转染组作为对照，用Western blot检测是否表达成功，并进一步检测共转TRIM50质粒和SNAIL质粒后对肝癌细胞生物学活性的影响。实验结果显示，TRIM50蛋白与SNAIL蛋白被成功过表达。转染SNAIL质粒后，TRIM50对肝癌细胞的克隆形成和侵袭能力的抑制作用被显著逆转。这些实验结果提示，TRIM50是通过对SNAIL的直接靶向泛素化修饰作用来发挥抑制HCC进展的作用效应的。　　5裸鼠成瘤实验模型验证TRIM50对肝细胞肝癌的抑癌效应　　结论:　　1.TRIM50在肝癌组织中的mRNA水平和蛋白水平显著低于远端非癌肝组织，并且在低分化肿瘤、恶性程度高和发生转移的肿瘤中表达水平更加显著降低。　　2.TRIM50能够显著抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移、抵抗失巢凋亡和转移的能力。　　3.TRIM50通过RING结构域对SNAIL进行K48位泛素化修饰，进而逆转EMT过程，抑制肝细胞肝癌的进展。　　创新点及意义　　1.本课题首次证实了TRIM50在临床肝癌患者的肝癌组织中表达显著下调，并且进一步的临床资料分析提示TRIM50在肝癌组织中的低表达可能参与了肝癌的进展。　　2.本课题首次发现了TRIM50能够对肝癌细胞发挥抑癌效应。　　3.本课题首次提出了TRIM50通过直接靶向SNAIL，并通过RING结构域对SNAIL进行K48位泛素化修饰，进而逆转EMT过程，从而达到抑制肝细胞肝癌进展的作用效应。