肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是消化系统最常见肿瘤之一。HCC患者确诊时，仅有20％能进行手术治疗；术后5年生存率约35％。对失去手术机会或术后复发的HCC患者，目前尚无有效的治疗手段。近年来，非细胞毒性药物的出现，给肝癌的治疗带来了希望。 生长抑素类似物奥曲肽和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制剂可抑制肝癌的生长。但缺乏有关这两种药物治疗肝癌机制方面的深入研究。非选择性COX抑制剂阿司匹林联合奥曲肽能协同抑制肝癌生长，选择性COX-2抑制剂联合奥曲肽是否也能协同抑制肝癌生长，尚不清楚。探讨这两种药物非细胞毒性药物对肝癌生物学行为的影响，有助于对肝癌发病机制的深入了解，增加肝癌治疗的新途径。 目的：探讨(1)选择性不同的COX-2抑制剂对HCC的生长抑制作用有无差异；(2)高选择性COX-2抑制剂-罗非昔布能否抑制HCC在体内的生长；(3)罗非昔布联合奥曲肽能否在体内、外协同抑制HCC生长及其可能的机制。 方法：(1)采用~3H-胸腺嘧啶掺入法观察三种对COX-2有不同选择性的COX-2抑制剂(美洛昔康、塞来昔布、罗非昔布)，以及罗非昔布联合奥曲肤对体外培养的人肝癌细胞株SMMC-7721生长的影响。(2)采用TUNEL染色法及AnnexinV标记法检测药物对肝癌细胞凋亡的影响。(3)采用SMMC-7721人肝癌细胞株建立人肝癌裸鼠原位移植瘤，观察罗非昔布单用和联合奥曲肤对体内肝癌生长的影响。(5)采用R工PCR技术检测肝癌细胞COX一2基因的表达。(6)免疫组化法观察罗非昔布或奥曲肤对肝癌细胞或组织的PCNA及vEGF蛋白表达的影响。(7)肿瘤组织Vnl因子抗体免疫组化染色，观察罗非昔布及其联合奥曲肤对肝癌血管生成的影响。(8)采用westem blot技术分析罗非昔布对肝癌细胞COX一2表达的影响，以及罗非昔布或奥曲肤对肝癌细胞e一Fos、ERK、p65、I忍a、IKK等蛋白表达的影响。(9)明胶酶法及R工PCR法检测罗非昔布或奥曲肤对肝癌细胞MN田一2酶原的基因及蛋白表达的影响。(10)采用凝胶迁移电泳技术检测罗非昔布/奥曲肤对肝癌细胞株AP一1及NF一忍活性的影响。 结果:(1)Cox一2抑制剂一美洛昔康、塞来昔布、罗非昔布对体外培养的SMMC一7721的3H一TdR掺入均有抑制作用，HCC细胞的，H一TdR掺入与三种药物浓度呈显著负相关(二一0.972一0.997，p<0.05);使Hee细胞’H一T叹掺入降低50%(Ies。)的浓度分别:s.55xlo一smo一几(美洛昔康)、 l.22xlo一‘mol几(塞来昔布)、6.27xlo一gmol几(罗非昔布)。(2) TtJNEL染色显示，Hcc细胞经三种选择性Cox一2抑制剂(1 xlo一smol几)作用24h后，光镜下可见许多散在分布、核染成棕黄色的凋亡细胞。细胞凋亡率分别为:14.6%士2.79%(美洛昔康)、21.6%士3.59%(塞来昔布)、27.1%士3.56%(罗非昔布)，对照组仅偶见凋亡。 重庆医科大学博士学位论文(3)eOX一2基因分析SMMC一7721细胞有COX一2基因表达。(4)经一X10一mol几奥曲肚作用后，肝癌细胞ERK一1和ERK一2蛋白表达量均明显低于对照组，当与1 xlo一smol几罗非昔布联合应用时，能进一步下调罗非昔布导致的肝癌细胞ERK一l和ERK一2蛋白表达降低。(5)经罗非昔布作用后肝癌细胞的pCNA、VEGF、e一Fos、p65、I出a、IKKa/p的表达水平较对照组显著降低;1 x 10一7mof几奥曲肤对上述肝癌细胞蛋白的表达没有影响，与罗非昔布联用时能进一步降低罗非昔布导致的上述蛋白表达的下调。罗非昔布联合奥曲肤组的裸鼠肝癌移植瘤组织血管密度较罗非昔布组显著减少。(6)罗非昔布可使肝癌细胞MMP一2酶原及其基因表达降低;1 xlo一7mol几奥曲肤则对其没有影响，当与罗非昔布联用时可进一步下调罗非昔布导致的肝癌细胞入。吐P一2的基因和蛋白表达降低。(7)肝癌细胞有低水平的妙一1活化，经20%血清刺激后，AP一1的结合力显著增加，罗非昔布能抑制这种刺激作用。(8)1义10一7mol几奥曲肤对”一1及哪一忍的结合力没有影响，与罗非昔布联合时能显著增强罗非昔布对肝癌细胞AP一1及NF一出活性的抑制作用。(9)单用罗非昔布对肝癌原位移植瘤的抑瘤率为73.16%，罗非昔布联合奥曲肤时抑瘤率为97.11%。(10)与对照组比较，罗非昔布组及联合用药组的肿瘤组织纤维增生明显。(n)长期单用罗非昔布或联合奥曲肤，裸鼠未出现明显副作用。 结论:(1) COX一2抑制剂的选择性越高，对肝癌细胞生长的抑制作用越强，在三种选择性COX一2抑制剂中，罗非昔布对肝癌生长的抑制作用最强。(2)罗非昔布联合奥曲肤对肝癌生长的抑制作用显著 重庆医科大学博士学位论文强于单用罗非昔布的效果。罗非昔布联合奥曲肤可协同增加对人肝癌细胞在体外生长的抑制作用，也明显提高对肝癌裸鼠原位移植瘤的抑瘤率。联合用药的抑制效应优于单独用药。(3)罗非昔布与奥曲肤通过下调VEGF及MN田一2酶原表达，协同增强了肝癌相关血管生成。(4)由于在MAPK、妙一1及N’F一沼信号转导通路的多环节具有协同抑制作用，故联合用药更显著地抑制了肝癌细胞的增殖和诱导其凋亡。