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目的骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stemcell,BMSCs)具有多向分化潜能。课题组已有实验表明在加入EGF、IGF-1等生长因子的条件培养基诱导下BMSCs能表达CK,向上皮分化。但BMSCs何时表达EGF-R和IGF-1-R以及该受体与细胞分化为上皮细胞的关系尚未见相关报道。本实验拟测定BMSCs EGF-R和IGF-1-R的表达时间;在加入EGF或IGF-1诱导后BMSCs表达EGF-R、IGF-1-R和CK的变化;以及加入受体阻断剂后培养的BMSCs是否还能分化为上皮细胞。拟通过本实验研究EGF、IGF-1诱导BMSCs分化的机制,为BMSCs在细胞移植治疗以及组织工程研究提供理论依据和实验方法。第一部分胎儿BMSCs表达EGF受体和IGF受体及体外诱导分化1.收集3～5个月胎龄引产胎儿四肢骨骨髓,分离、培养、扩增获得BMSCs。比较11～13周的标本和20～24周标本获得的BMSCs的生长特点。结果:13周以内标本获得的细胞扩增到P4时,数量多于20～24周标本;首次传代时间早,衰老出现时间晚。2.检测BMSCs EGR-R和IGF-1R出现时间。从P3开始,用免疫组织化学染色法每天检测EGF-R、IGF-1-R的表达。结果显示:EGF-R首次表达为P4第4d～P5第3d;IGF-1-R首次表达为P5第2d～P6第2d。3.分别用EGF 30ng/mL,IGF-1 50 ng/mL,EGF 30 ng/mL+IGF-1 50ng/mL诱导P3-BMSCs,设立无生长因子对照组,检测EGF-R、IGF-1-R和CK的表达。结果:EGF和IGF-1诱导组细胞表达EGF-R和IGF-1-R较对照组提前2～4天;CK表达最早出现在P4诱导后2天,对照组P6第4d出现微弱的CK表达。4用抗EGF-R抗体2mg/mL或抗IGF-1-R抗体1.5mg/mL孵育P5-BMSCs 4h后,分别加入含EGF 30ng/mL、IGF-1 50ng/mL的培养基培养,同时另设4个对照组:EGF 30ng/mL,IGF-1 50ng/mL,EGF30ng/M1+IGF-1 50ng/mL和空白对照组。检测EGF-R、IGF-1-R和CK的表达。结果:EGF-R和IGF-1-R阻滞后,第4d可检测到CK,但CK~+细胞率和强度均低于加入生长因子诱导组(P＜0.05),接近空白对照组。第二部分羊膜体外诱导胎儿BMSCs的分化1.取10例羊膜,用机械分离和氢氧化铵法去除上皮,制成羊膜结缔组织,光镜观察其表面无上皮细胞。2.将3.0×10~5个DAPI标记的P4-BMSCs种植于羊膜上,分别用EGF 30ng/mL,IGF-1 50ng/mL,EGF 30 ng/mL+IGF-1 50 ng/mL联合诱导,同时设无生长因子的羊膜对照组和生长因子诱导的细胞爬片对照组。各组诱导24～28d后,经免疫荧光染色后,CLSM下见羊膜铺片和切片上有DAPI蓝色荧光标记核,同时胞质中有CK绿色荧光的细胞,表明BMSCs己分化为上皮细胞。3.诱导培养第10d,各组BMSCs表达CK细胞率统计结果显示:单用羊膜或者羊膜浸提液诱导BMSCs分化为上皮的能力强于对照组,P＜0.05;羊膜与EGF、IGF-1联合诱导作用强于单用羊膜组,P＜0.05;终浓度30ng/mL EGF的诱导作用强于50ng/mL IGF-1,P＜0.05。4.TEM下见羊膜上种植的BMSCs与结缔组织见未见基膜形成,细胞问未见细胞连接。全文结论1.13周以内标本获得的骨髓细胞首次传代时间早,衰老出现时间晚;扩增到P4时,BMSCs数量多于20～24周标本。2.P4-BMSCs开始表达EGF-R,P5-BMSCs开始表达IGF-1-R。提示此时是施加EGF、IGF-1等生长因子的合适时间。3.EGF和IGF-1诱导后,EGF-R和IGF-1-R表达CK的时间早于对照组。表明EGF和IGF-1可促进BMSCs表达EGF-R和IGF-1-R,以及BMSCs向上皮细胞分化。4.P3-BMSCs的EGF-R和IGF-1-R阻滞后,其向上皮细胞分化的时间和数量均低于对照组,证明EGF-R和IGF-1-R可能参与了BMSCs向上皮细胞分化的调控。5.BMSCs能在去上皮羊膜上生长,并分化为能表达CK的上皮细胞。去上皮羊膜,外源性EGF和IGF-1,以及羊膜结缔组织浸提液在体外都能诱导BMSCs向上皮细胞分化,以羊膜与外源性EGF和IGF-1联合诱导作用最强,EGF的诱导作用强于IGF-1。6.BMSCs在羊膜上培养28d,可生长呈复层,并表达上皮细胞的标记物-CK,但电镜下BMSCs与羊膜结缔组织间未见基膜形成,细胞间亦未见细胞连接。可能基膜、细胞连接的形成需要更长的时间,或者更适宜其分化成熟的培养条件。