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[目的]:
1.本研究主要从基因组水平研究临床主要病原菌-肺炎克雷伯菌的质粒DNA的结构;
2.进一步分析质粒所携带的功能基因,研究质粒与宿主菌的耐药性和致病性等的关系;
3.为以后分析肺炎克雷伯菌的质粒谱、质粒DNA结构的演变规律和分子进化打下基础。
[方法]:
1.参照《全国临床检验操作规程》,并经法国生物梅里埃公司(bioMerieux)Vitek60细菌鉴定仪鉴定,我们从温州医学院附属第一医院临床送检的血液、腹水、尿液等体液中分离得到2006年2月-8月24株肺炎克雷伯菌。
2.采用碱裂解法提取质粒DNA,电泳分析细菌的质粒谱,选取含大质粒多重耐药性菌株为待研究菌株。
3.大量提取选定菌株的质粒DNA;构建质粒基因组小片段文库FOESMID文库并测序。
4.采用美国华盛顿大学提供的Phred/Phrap/Consed软件包进行序列拼接,然后用美国TIGR研究所提供的Gliminer软件预测ORF,进一步对这些基因进行功能分析。
5.利用Blast软件进行序列同源性比较、Clustal软件进行系统进化树构建。
[结果]:
1.成功构建了一个包含所有质粒DNA的大小为2-3kb的pUC18文库和35-40kb片段大小的FORSMID文库。
2.测序拼接后得到3个环状双链DNA质粒:其中pKF3-70的大小为69,477bp,G+C平均百分含量为52.4%,预测共编码92个ORFs,编码序列占整个基因组的78.3%,在这92个ORFs中73.9%在已知数据库中有同源基因,能够赋予功能,15.2%的ORFs编码保守的假定蛋白,剩余10.7%的ORFs在已数据库里没有同源蛋白序列。pKF3-90测序大小为91,327bp,预测共编码114个ORFs,G+C平均百分含量为51.9%,编码序列占整个基因组的85.2%。预测的编码ORFs中,有49.1%ORFs在已知数据库中有同源基因,能够赋予功能,45.6%ORFs编码保守的假定蛋白,剩余5.3%ORFs在已数据库里没有同源蛋白序列。
3.在pKF3-70和pKF3-90上同时发现了耐药性基因(β-内酰胺酶)、和接合转移系统基因、可移动DNA元件等。其中pKF3-70编码了毒力相关基因(铁转运系统透过性酶基因等),pKF3-90编码了毒力相关基因(hok基因、溶血素调控蛋白基因等)。
[结论]:
1.本文成功地分离并测序分析了临床重要病原菌肺炎克雷伯菌的质粒DNA全序列。
2.在这两个质粒上都出现有未知功能的蛋白,特别是在pKF3-90上有50.9%的编码蛋白是未知的,有可能是该细菌特有的蛋白,其功能还有待与我们进一步的研究。
3.在这2个质粒上都有编码一整套F质粒相关的接合转移系统基因(F-tra系统基因),表明这2个大质粒可在不同菌种或菌株中进行接合转移。
4.这2个质粒都编码耐药性相关基因和毒力相关基因等,由于这2个质粒都是可接合转移质粒,可以将耐药基因在细菌间进行基因水平转移,这样造成了耐药菌的播散,给人类的健康带来了威胁。
5.分析临床重要病原菌的功能性质粒,无论对于研究细菌耐药性机理和致病机理,或是指导临床合理用药,都具有重要意义。