机体免疫系统中,固有免疫在抵抗外来病原微生物感染中发挥重要的作用,固有免疫细胞通过模式识别受体(PRR)识别微生物结构上高度保守的病原相关分子模式(PAMP),然后经过一系列的信号级联反应来调控不同效应分子的表达。其中TOLL样受体(Toll-like Receptors, TLRs)作为重要的模式识别受体受到广泛的关注,用相应的配体如LPS, PGN等刺激固有免疫细胞后,TLRs细胞膜内侧TIR (Toll/IL-1receptor homologous region)结构域募集MyD88, TRAF6, IKKβ等接头分子,最终促进NF-κB等转录因子的活化,活化的转录因子与相应的反应原件结合后,诱导大量的炎性细胞因子、趋化因子等的产生,从而促进炎症反应的发生。其中TLR4(Toll-like Receptor4)和TLR2(Toll-like Receptor2)识别LPS和PGN后可以通过活化NF-κB的方式促进IL-6, TNF-α等细胞因子的表达,其产生的炎性细胞因子在清除病原微生物感染中发挥重要的作用,但是TLRs的过度活化以及相应炎性细胞因子的过度产生,将引发一系列与炎症相关的疾病,尤其是自身免疫性疾病。因此,对促炎性细胞因子产生的机制研究显得尤为重要。IKB激酶结合蛋白(IKK-interacting protein, IKIP)是人类近期发现的一个新分子,经过基因剪切后形成3个转录体,并翻译成相应的蛋白分子发挥功能。有报道称,X射线照射能促进IKIP的表达,在内皮细胞中,p53可以调控IKIP的表达,在细胞凋亡过程中发挥重要功能,作者通过酵母双杂交的实验发现IKIP可以与NF-κB上游的激酶IKKβ结合。由于IKKβ介导NF-κB活化的途径在TLRs信号通路中同样发挥着重要作用,因此IKIP是否参与TLRs信号通路,以及是否可以通过影响IKKβ进而调控NF-κB介导的炎症反应都有待进一步研究。研究目的：1、检测LPS, PGN等TLRs配体刺激巨噬细胞后,IKIP的表达量是否发生变化；2、探讨IKIP是否影响LPS, PGN等TLRs配体诱导的促炎细胞因子的表达；3、探讨IKIP调控TLRs信号通路中的NF-κB活化的分子机制。研究方法：1、LPS, PGN刺激巨噬细胞,检测IKIP的表达。C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6%),72小时后,取出诱导产生的的原代腹腔巨噬细胞(Macrophage),经LPS, PGN刺激0、2、4、8、12、24h,Trizol方法提取RNA,并进行反转录得到cDNA,最后用PCR方法检测IKIP在mRNA水平的表达变化。同样的方法取出巨噬细胞后,用LPS, PGN刺激相应的时间点,然后收取蛋白,用western-blot的方法检测IKIP蛋白水平的表达变化。2、检测IKIP对促炎细胞因子的作用。2.1转染IKIP的siRNA后,western-blot方法检测IKIP siRNA的干扰效率将IKIP的干扰RNA (siRNA)及阴性对照干扰RNA (snRNA)转染入人胚胎肾细胞系HEK293(Human Embryonic Kidney HEK293, HEK293),静置培养24h,再转入Flag-IKIP表达载体,24h后收取蛋白,用BCA方法调整浓度一致,western-blot检测IKIP蛋白水平的变化。2.2转染IKIP siRNA后,LPS、PGN刺激巨噬细胞,检测促炎性细胞因子的表达变化验证IKIP相应的siRNA干扰效率后,选取高干扰效率的siRNA,将其转染入腹腔巨噬细胞,48h后,用LPS刺激巨噬细胞相应时间点,提取RNA,进行反转录,利用PCR技术分析炎性细胞因子IL-6, TNF-α以及I型干扰素mRNA水平上的表达变化。将Flag-IKIP表达载体转染Hela细胞系,24小时后用LPS刺激相应时间点,RT-PCR方法检测促炎细胞因子IL-6, TNF-α和I型干扰素的表达变化。将Flag-IKIP表达载体转染HEK293-TLR2细胞系,4小时后用PGN刺激相应时间点,RT-PCR方法检测促炎细胞因子IL-6, TNF-α和I型干扰素的表达变化。3、IKIP对TLRs信号通路中NF-κB活化调控的分子机制研究。3.1转染Flag-IKIP表达载体和TLRs信号通路接头分子表达载体以及NF-κB, IFN-β报告基因质粒后,检测NF-κB,IFN-β报告基因活性的变化情况首先将Flag-IKIP表达载体和TLRs信号通路不同的接头分子的表达载体以及NF-κB, IFN-β报告基因质粒共同转入HEK293细胞,24小时后,收取细胞,用双荧光素酶报告基因的方法检测IKIP对NF-κB报告基因活性的影响以及对IFN-β报告基因活性的影响,分析IKIP影响NF-κB活性的可能靶点。3.2干扰IKIP后,Western-blot检测NF-κB及相关内源性蛋白分子的磷酸化情况将验证好的siRNA转染巨噬细胞48h后,用LPS刺激巨噬细胞相应时间点,收取蛋白,调整浓度一致后,western blot方法检测NF-κB及相关内源性蛋白分子的磷酸化情况,进一步确定IKIP对NF-κB通路的影响。3.3验证IKIP与IKKβ的结合将Flag-IKIP表达载体与HA-IKKP表达载体共同转入Hela细胞系或HEK293-TLR2细胞系后,分别用LPS或者PGN刺激2h,收取蛋白,通过免疫共沉淀(Immunoprecipitation, IP)方法检测两个分子的结合情况。3.4IKIP对IKK复合物形成的影响。首先将Flag-IKIP表达载体与HA-IKKβ, HA-IKKα, HA-IKKγ表达载体共同转入Hela细胞系24小时后,再用LPS刺激相应时间后,收取蛋白,通过免疫共沉淀的方法进一步明确IKIP与IKK复合物中IKKβ分子的结合情况。为进一步明确作用方式,通过剂量竞争实验,转染不同剂量的MYC-IKIP表达载体和相同剂量的HA-IKKβ, HA-IKKγ表达载体于Hela细胞,24小时后用LPS刺激相应时间点,收取蛋白,通过免疫共沉淀方法检测随着IKIP的剂量的增加,IKKβ与HA-IKKγ结合是否发生变化。研究结果：1、LPS、PGN刺激巨噬细胞后,IKIP的表达量随着刺激时间的增加发生明显上调。C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6%),72小时后,取出诱导产生的的原代腹腔巨噬细胞(Macrophage),经LPS, PGN刺激0、2、4、8、12、24h,Trizol方法提取RNA,并进行反转录得到cDNA,最后用PCR方法检测发现,IKIP mRNA的表达随着时间的增长而显著增加。同样的方法取出巨噬细胞后,用LPS, PGN刺激相应的时间点,然后收取蛋白,用western-blot的方法检测发现,随着刺激时间的增加,IKIP蛋白水平的表达也明显增加。结论：通过LPS、PGN刺激巨噬细胞,IKIP的表达明显上调2、IKIP抑制促炎细胞因子的产生2.1IKIP siRNA的干扰效果的验证将IKIP相应的干扰RNA (siRNA)转染入HEK293细胞24h后,再转入Flag-IKIP载体,24h后收取蛋白,用BCA方法调整浓度后, western-blot检测IKIP蛋白。IKIPsiRNA可以显著抑制FLAG-IKIP的表达。2.2IKIP抑制促炎细胞因子的分泌将验证好的siRNA转入原代腹腔巨噬细胞48小时后,再用LPS, PGN分别刺激4小时,8小时,收取细胞,提取RNA,进行反转录,后用PCR分析,发现与对照组相比,干扰IKIP后,促炎因子IL-6, TNF-α的表达明显上调。而IFN-β无明显的变化。把Flag-IKIP载体分别转入Hela和HEK293-TLR2细胞24小时后,LPS刺激Hela, PGN刺激HEK293-TLR2细胞,提取RNA,进行反转录,用PCR方法,与对照组相比,检测促炎性细胞因子IL-6, TNF-α的表达明显下调。而IFN-β的表达无明显的变化。3、IKIP抑制NF-κB活性。3.1IKIP抑制NF-κB报告基因的活性将Flag-IKIP, TLRs信号通路不同的接头分子以及NF-κB报告质粒,IFN-β报告质粒共转染HEK293细胞后,24小时后,收取细胞,通过双荧光素酶报告基因的方法检测,与对照组相比,IKIP实验组可显著降低MyD88、IKK-P所诱导的NF-κB报告质粒的荧光素酶活性。对TRIF, MyD88所介导的IFN-β报告质粒的荧光素酶活性没有影响,进一步说明IKIP可NF-κB的活化。3.2Western-blot检测IKIP对NF-κB相关的内源性蛋白的影响将验证好的siRNA转染巨噬细胞48h后,LPS分别刺激巨噬细胞30分钟,60分钟,收取蛋白,用BCA的方法调整蛋白浓度,western blot检测pIκB,pP65, IκBα, P65的变化,与对照组相比,发现干扰IKIP后,pIκB, pP65蛋白水平明显上调；I-KBa降解增加,进一步说明IKIP对NF-κB的活化起到抑制作用。4、IKIP通过抑制IKKγ结合IKKβ负向调控NF-κB活化4.1IKIP结合IKKβ将Flag-IKIP与HA-IKKP载体共同分别转入Hela细胞,HEK293-TLR2细胞24h后,再用LPS刺激2h,收取蛋白,免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, IP)的方法,检测到Flag-IKIP与HA-IKKP两个分子的结合。结果表明,LPS刺激后可以诱导IKIP结合IKKβ。4.2IKIP通过与IKKγ竞争的方式结合IKKβ负向调控NF-κB活化将Flag-IKIP与HA-IKKβ, HA-IKKα, HA-IKKγ载体共同转入Hela细胞24小时后,再用LPS刺激2h,收取蛋白,通过免疫共沉淀的方法进一步检测到IKIP仅仅与IKK复合物中IKKβ结合,而不是与其复合物的结合。为进一步明确结合IKKβ, IKIP的作用方式,我们又采取剂量竞争实验,转染不同剂量的MYC-IKIP和相同剂量的HA-IKKβ, HA-IKKγ于Hela细胞,LPS刺激2小时后,收取蛋白,IP的方法检测到随着IKIP剂量的增加,与IKKβ结合的IKKγ的量减少,表明,IKIP通过与IKKγ竞争结合IKKβ,影响IKK复合物的活性,来发挥抑制作用的。结论：1、LPS、PGN可以诱导巨噬细胞中IKIP的表达量。2、IKIP抑制LPS、PGN诱导的促炎因子及I型干扰素的产生。3、IKIP负向调节NF-κB信号通路。4、IKIP通过与IKKy竞争结合IKKβ,影响IKK复合物的形成,负向调控NF-κB的活性,发挥抑制炎症过度反应的作用。创新点及意义：1、本研究首次证实了IKIP可以参与TLRs信号通路的调控,而且通过进一步实验阐明了这种抑制作用主要机制,即IKIP通过与IKKy竞争结合IKKβ,影响IKK复合物的形成,进而负向调控NF-κB的活性。2、固有免疫中炎症反应受到精细的调控,炎症的过度活化必定会引起一些炎症性疾病和自身免疫性疾病,本研究为负性调控NF-κB炎症反应提供了新的实验证据,为炎症性疾病的研究、诊断和治疗提供了新的思路。