由于外伤、炎症、长期缺牙等原因,种植术区常常会遇到骨组织或软组织缺损的问题,需要进行各种种植外科手术,如引导骨再生、骨劈开、上颌窦底提升等,而软组织的良好愈合是种植外科手术成功的前提。良好的软组织愈合能够阻挡细菌侵入,为骨再生、种植体骨结合(osseointegration)提供良好的微环境;健康的牙龈袖口有助于获得良好及稳定的修复效果,因此,在种植手术后,软组织愈合质量的好坏,能否形成良好的生物学封闭,直接影响种植外科手术的成功与否。近年来,国内外学者为了加快软组织愈合速度,提高软组织愈合质量,做了大量的相关研究。临床上常采用局部软组织瓣处理、自体结缔组织游离瓣移植、自体黏膜游离瓣移植等方法关闭创面,但是,这些方法均会提升手术难度,造成“第二术区”,增加患者痛苦,且效果有限,易发生术后并发症。近年来,脱细胞真皮基质开始被应用于口腔黏膜的修复,但是,其仍具有价格昂贵、伦理学争议、疾病传播风险、创口局部免疫反应等问题。因此,学术界一直在寻找安全可靠、价格低廉、能够促进牙龈软组织再生、避免生物安全性风险且具有抗感染能力的生物材料,这种材料无疑具有巨大的临床价值。富白细胞-血小板纤维蛋白(Leukocyte-platelet-rich fibrin,L-PRF)是由Choukroun等人首次提取的。L-PRF作为一种富含血小板及多种生长因子的自体血小板浓缩物(platelet concentrates,PCs),制备简单,不需要添加任何抗凝剂及外源性凝血酶和胶凝剂,具有高效的促进组织再生能力,具有良好的临床应用潜力。因此,本研究拟探讨PRF对软组织愈合及炎症调节的影响,为促进口腔种植体周围软组织愈合提供理论依据。具体研究内容包括以下几个方面:1.人牙龈成纤维细胞的培养及体外炎症模型的建立。本研究利用组织块酶消化法培养人牙龈成纤维细胞,增殖迅速,细胞纯化效果好,成功率高,能够快速大量获得原代细胞。体外炎症模型的建立是后续研究的基础。本研究通过CCK-8法筛选牙龈卟啉单胞菌-脂多糖(Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide,Pg-LPS)安全浓度,确定1μg/ml为Pg-LPS的安全浓度,不影响细胞的正常生长。然后利用实时qPCR确定Pg-LPS最佳刺激时间,实验结果显示:1μg/ml的Pg-LPS能够刺激成纤维细胞释放促炎因子,并在3h和6h后,达到释放峰值,以此作为后续实验的检测时间点。2.L-PRF的结构和生长因子的释放。本实验使用扫描电子显微镜观察L-PRF的超微结构,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测L-PRF中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、血小板衍生因子AA(Platelet derived growth factor-AA,PDGF-AA)和类胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)的浓度。扫描电镜观察L-PRF具有富含高纤维蛋白的三维网络结构,在黄红交界处滞纳大量血小板和白细胞,同时至少在10天内持续释放组织愈合相关的生长因子(TGF-β1、PDGF-AA和IGF-1),具有一定的长效性,因此,我们认为,L-PRF在调节组织愈合方面具有很大的潜力。3.L-PRF对人成纤维细胞增殖的影响及对炎症的调节。本实验通过CCK-8(cell counting kit-8)检测了L-PRF对人牙龈成纤维细胞增殖能力的影响。通过显微镜观察L-PRF对衰老细胞增殖的影响,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测L-PRF对Pg-LPS刺激的成纤维细胞炎症因子释放的影响。CCK-8结果显示,100%、50%和25%的L-PRF条件培养基均可促进人牙龈成纤维细胞增殖,并且呈现一定的浓度依赖性。其中100%的L-PRF条件培养基促进增殖效果最明显。因而,选择100%的L-PRF条件培养液作为最佳浓度进行后续实验。显微镜观察L-PRF条件培养基培养衰老细胞结果显示,L-PRF能够恢复衰老的HGFCs细胞的生物学特性,促进衰老细胞增殖。ELISA结果显示用1□g/ml的Pg-LPS刺激人牙龈成纤维细胞6小时后,人牙龈成纤维细胞分泌的IL-1□,TNF-□,和IL-6显著升高,而令人惊讶的是,经L-PRF处理后,Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞分泌IL-1□,TNF-□,和IL-6受到了显著抑制。4.L-PRF参与炎症调节的体外研究。本实验建立了兔体内组织炎症模型,观察动物体重变化,创口愈合面积和组织苏木精和伊红染色评价L-PRF对口腔组织炎症的调节作用。本研究使用50%醋酸对口腔牙龈进行直接刺激,并在第4天引起了口腔炎症。醋酸处理后第4天口腔粘膜炎面积达到最大值。口腔溃疡形成后,第7天对照组的实验动物体重减轻,但于第14天又恢复。与之对比,L-PRF处理组的体重随时间增加,实验组和对照组在第7天和第14天体重差异显著。在第7天L-PRF治疗组的溃疡面积明显小于对照组,这意味着该组的愈合速度更快。第14天,L-PRF治疗组的粘膜溃疡明显缩小,且成为面积最小的组。HE染色镜下组织病理学检查,刺激前正常对照的标本上皮完整,无炎性细胞浸润。刺激后,在第7天,上皮层破坏明显,随后上皮层厚度发生改变,对照组的炎症细胞浸润更为严重。第7天,L-PRF治疗组开始了不完全的上皮再生,且愈合过程比对照组更快,表现为溃疡更小,炎症细胞浸润更少。第14天,治疗组基本恢复,再上皮化接近完成,创面愈合速度明显快于对照组。第21天,两组均完成再上皮化,L-PRF组的愈合明显完全。5.L-PRF对种植体周围组织愈合及术后炎症控制的影响:随机对照临床研究。本研究建立了一项前瞻性随机对照临床研究,以评估白细胞-血小板富纤维蛋白(L-PRF)对种植体周围组织反应的影响。本临床研究于2016年2月至2017年11月在吉林大学附属口腔医院进行,随机选取20例患者(男15例,女5例),平均年龄38岁(30-44岁),种植20颗植体。每组均有10个种植位点,其中I组为PRF组(试验组),II组为无PFR组(对照组)。通过术后疼痛评估,黏膜肿胀评估,创口愈合面积评估,术后种植体近远中骨高度和牙周袋深度变化测定,术后患者满意度调查几方面评价L-PRF对种植体周围组织愈合及术后炎症控制的影响。研究结果表明L-PRF能够显著减少术后疼痛和黏膜肿胀,加快创口愈合速度,骨水平增量和牙周健康都得到了保障,患者对整个种植修复过程感到满意。因此,这些病例显示了L-PRF促进种植体周围组织愈合的成功应用,为进一步临床应用提供了新的思路。综上所述,L-PRF对种植体周围组织愈合及炎症调节具有积极调节作用。