研究背景糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)危害最大的微血管并发症之一,确切的发病机制尚未完全阐明。肾小球脏层上皮细胞,即足细胞(podocyte)损伤改变在糖尿病肾病出现蛋白尿及发展过程中起重要作用。DN早期即出现足细胞损伤,进一步发展为出现蛋白尿,加速肾脏病变进展。目前关于在糖尿病肾病早期足细胞损伤的机制并不十分清楚。近年来已认识到足细胞上某些蛋白分子参与信号的传递,对维持足细胞正常结构起着重要作用,它们的突变或缺失可导致足细胞结构和数目改变,引起蛋白尿和肾小球硬化的发生。a3β1整合素是足细胞粘附于肾小球基底膜(GBM)的主要粘附分子,参与维持足细胞正常形态、GBM通透性和足细胞内外信号的传导。予足细胞α3β1整合素拮抗剂,足细胞与细胞外基质粘附力下降,凋亡增加。α3或β1整合素缺失鼠肾脏肾小球基底膜断裂层化,滤过屏障受损,足突退化,足细胞密度严重减少,产生大量蛋白尿。糖尿病患者或糖尿病大鼠足细胞整合素α3β1整合素的表达受抑,并随病程的延长、血糖的升高,这种抑制作用加重。有研究显示机械应力、血管紧张素Ⅱ、转化生长因子β1、活性氧等均可调控足细胞α3β1整合素表达。厄贝沙坦(Irbesatan)是一种高选择性的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的AT1受体拮抗剂(ARB),大量基础临床证据显示厄贝沙坦可选择性与AngⅡ1型受体结合,阻断AngⅡ-醛固酮系统的生物学效应,通过阻断肾小球出球小动脉的AngⅡ受体导致出球小动脉扩张,直接降低肾小球灌注压减少尿蛋白滤过还可阻断AngⅡ介导的增大肾小球滤过膜孔径的作用,改善滤过膜通透性,减少蛋白漏出,且其肾脏保护作用呈剂量依赖性。因此我们提出以下假设：厄贝沙坦的剂量保护效应可独立于降压作用外,通过调控肾脏局部AnglⅡ影响肾组织0α3β1整合素表达,减少足细胞丢失,进而改善滤过屏障受损、延缓糖尿病肾病病变。本研究拟通过整体研究,予不同剂量厄贝沙坦干预糖尿病大鼠,观察肾脏局部AngⅡ、肾组织α3β1整合素、肾小球足细胞密度变化,阐明各因素的相关性,为厄贝沙坦剂量相关的肾脏保护作用机制提供部分动物实验依据,为糖尿病肾病预防与应对措施提供新思路。第一章厄贝沙坦对糖尿病大鼠独立于降压以外的肾脏保护作用及其剂量相关性探讨[目的]1、观察不同剂量厄贝沙坦对STZ诱导的糖尿病大鼠尿微量白蛋白排泄率、肾小球足细胞数量、肾脏病理的影响；2、探讨厄贝沙坦降压以外的肾脏保护作用及其剂量相关性。[方法]1、糖尿病大鼠模型的制备和分组：63只雄性Wistar大鼠(南方医科大学实验动物中心),体重240-280g。按体重分层后随机分为3组,分别为正常对照组(Ctrl组,n=7)、糖尿病对照组(DM组,n=14)和药物干预组(n=42)。禁食过夜后,糖尿病对照组和药物干预组大鼠56只一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)55mg／kg,72小时后剪尾取血,测尾血全血血糖>16.7mmol／L作为糖尿病模型。造模过程中,DM组死亡3只,药物干预组死亡6只。药物干预组糖尿病大鼠按体重再次随机分为4组,于造模成功4周后分别给予25mg／kg·d厄贝沙坦(DM+Irb25组,n=9)、50mg／kg·d厄贝沙坦(DM+Irb50组,n=9)、200mg／kg·d厄贝沙坦(DM+Irb200组,n=9)和30mg／kg·d肼屈嗪(DM+Hyd组,n=9)干预8周。造模后前4周,对血糖值≥30mmol／L的糖尿病大鼠予皮下注射长效胰岛素来得时(Sanofi-anvitis公司,法国),2-4 IU／隔日,以避免酮症的出现和保持大鼠生命活力。2、厄贝沙坦(Sanofi-anvitis公司,法国)及肼屈嗪(Sigma,美国)用药量根据大鼠体重计算。溶于清洁饮水中灌胃给药,每天一次。正常对照组和糖尿病对照组给予相应体积饮水灌胃。所有大鼠饲养于恒温清洁环境(南方医科大学实验动物中心),自由进食及饮水。3、给药前及给药8周后,采用Powerlab生物信息采集系统(Adinstrument,澳大利亚)测大鼠尾动脉收缩期血压,待大鼠充分平静后,连续测鼠尾动脉收缩期血压三次,取其平均值为该鼠收缩期血压值。4、标本的留取：给药8周后,大鼠放入代谢笼,留取24小时尿液,计量尿量,尿液离心30分钟(4℃,4000rpm),取上清分装后于-700C冻存,用于尿肌酐及尿微量白蛋白的检测。大鼠麻醉后,经腹主动脉插管,4℃PBS灌注后取肾脏。迅速剥去肾包膜,称量肾重后纵向剖开肾脏,切取约0.5×0.5×0.2cm3大小的肾脏组织,置于10%中性福尔马林缓冲溶液中固定24小时,剩余部分放入冻存管中液氮保存,。5、尿微量白蛋白排泄率的检测：24小时尿微量白蛋白含量使用ELISA试剂盒(Rat albumin ELIS A quatitation kit, Behtyl Laboratories,美国)检测。6、肾组织形态学观察：10%中性福尔马林缓冲溶液固定,常规脱水、浸蜡、包埋。2μm石蜡切片,过碘酸席夫氏染色(PAS)染色,光镜下观察肾组织形态学变化。①每个肾小球横截面积(Ag),每张切片随机至少取20个肾小球,以Image pro plus 6.0测其截面积,取其平均值。②肾小球体积(Vg),计算公式Vg=1.25×(Ag)3/27、肾小球足细胞密度测定：10%中性福尔马林缓冲溶液固定,常规脱水、浸蜡、包埋、5μm石蜡切片。兔抗大鼠WT1多克隆抗体(Merk公司)免疫组化SP法检测肾小球WT1表达,Image-Pro Plus 6.0彩色图像分析系统半定量足细胞密度。8、统计方法采用SPSS13.0统计软件处理数据。计量资料用均数±标准差(X±SD)表示。各组间计量资料的分析采用One-way ANOVA和协方差分析,当P<0.05时用LSD法作多重比较。方差不齐性时,用Welch法校正,当P<0.05时用Games-Howell法作多重比较。干预前后计量资料的分析采用独立样本t检验。大鼠尾血全血血糖值的比较用多个独立样本非参数(Kruskal-Wallis H)检验。双变量不符合正态分布,相关分析采用Sperman相关分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。[结果]3.1实验动物的特性实验过程中,糖尿病对照组大鼠疑似高血糖诱发酮症死亡1只,50mg／kg厄贝沙坦干预组大鼠灌胃时死亡1只。造模成功后,糖尿病大鼠鼠尾血糖值较正常对照组明显升高；除正常对照组外,各组间鼠尾全血血糖值无显著差异(x2=0.126,P=0.998)。干预前糖尿病大鼠体重均显著低于正常对照组(P<0.001),糖尿病大鼠各组间无显著差异(P均>0.05)。3.2厄贝沙坦对糖尿病大鼠尾动脉收缩期血压(TCP)的影响药物干预组干预前,糖尿病大鼠TCP显著高于(P<0.001)正常对照组大鼠。药物干预后,以干预前血压为协变量,各组血压有显著差异(P<0.001)。3.3厄贝沙坦对糖尿病大鼠尿微量白蛋白排泄率(UAE)的影响糖尿病对照组大鼠的UAE显著高于正常对照组(P<0.001)。厄贝沙坦和肼屈嗪干预后,糖尿病大鼠的UAE较糖尿病对照组显著降低(P均<0.001)；不同剂量厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠的UAE显著低于肼屈嗪干预组(P均<0.05)。50mg／kg.d和200mg／kg·d厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠的UAE均显著低于25mg／kg-d厄贝沙坦干预组(P均<0.001)；50mg／kg.d和200mg／kg.d厄贝沙坦干预组组间UAE无显著差异(P>0.05)。3.4厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏质量指数(RMI)和肾小球体积(Vg)的影响糖尿病对照组大鼠的RMI显著高于正常对照组(P<0.001),表明糖尿病大鼠肾脏肥大。肼屈嗪干预后,该组大鼠的RMI较糖尿病对照组显著降低(P<0.01)。不同剂量厄贝沙坦干预后,其肾脏指数均显著低于糖尿病对照组(P均<0.001)和肼屈嗪干预组(P均<0.05)；50mg／kg.d和200mg／kkg-d厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠的RMI均显著低于25mg／kg.d厄贝沙坦干预组(P均<0.05)。200mg／kg.d厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠的RMI与50mg／kg·d厄贝沙坦干预组无显著差异(P>0.05)。糖尿病对照组大鼠的Vg较正常大鼠显著升高(P<0.001),表明糖尿病大鼠肾小球肥大。肼屈嗪干预后,该组大鼠的Vg较糖尿病对照组大鼠显著降低(P<0.001)。不同剂量厄贝沙坦干预后,大鼠的Vg显著低于糖尿病对照组(P<0.001)和肼屈嗪干预组(P<0.05)；50mg／kg.d和200mg／kg.d厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠的Vg显著低于25mg／kg.d厄贝沙坦干预组(P均<0.001)；50mg／kg.d和200mg／kg-d厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠的Vg无显著差异(P>0.05)。3.5光镜下糖尿病大鼠肾脏病变肾组织切片PAS染色光镜下表现：糖尿病对照组大鼠肾脏肾小球系膜轻度增生,肾小球肥大,肾小囊腔呈裂隙状,基底膜轻度增厚,系膜基质轻度增生,增殖的基质呈嗜伊红性,PAS染色阳性。肾小管上皮细胞肥大,病理染色见空泡和颗粒样变性。肾间质有大量淋巴细胞及单核细胞浸润,未见明显纤维化。小动脉无显著病变。厄贝沙坦干预后,糖尿病大鼠肾脏肾小球系膜基质增生、小管空泡样改变有改善。3.6肾小球足细胞密度糖尿病对照组大鼠肾小球足细胞密度较正常对照组显著降低(P<0.001)。药物干预组中,肼屈嗪干预后,该组大鼠肾小球足细胞密度较糖尿病对照组显著升高(P<0.001)；不同剂量厄贝沙坦干预后,糖尿病大鼠肾小球足细胞密度较糖尿病对照组显著升高(P均<0.01),200mg／kg.d厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠的肾小球足细胞密度显著高于肼屈嗪干预组(P<0.01)、25mg／kg.d厄贝沙坦干预(P<0.01)和50mg／kg.d厄贝沙坦干预组(P<0.05),肼屈嗪干预组、25mg／kg.d厄贝沙坦干预、50mg／kg.d厄贝沙坦干预组组间无显著差异(P>0.05)。3.7肾小球足细胞密度与尿白蛋白排泄率的相关性肾小球足细胞密度与尿白蛋白排泄率显著负相关,R=-0.794,P<0.001。[结论]1、厄贝沙坦显著降低糖尿病大鼠尿微量白蛋白、减轻肾脏肥大、肾小球肥大,改善足细胞的减少,延缓糖尿病大鼠肾脏病变的进展；在一定剂量范围范围内,厄贝沙坦的的肾脏保护作用呈剂量依赖性。2、糖尿病大鼠足细胞的丢失可能是蛋白尿发生的原因之一。3、厄贝沙坦可能还具有降压以外的改善滤过屏障、延缓糖尿病肾病病变的作用。其具体机制尚有待于进一步的研究。第二章厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏局部AngⅡ、肾小球α3p1整合素表达的影响[目的]观察厄贝沙坦(Irbesartan)对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏局部AnglⅡ水平、及肾α3β1整合素表达的影响并分析其剂量相关性。探讨厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护作用的途径,为ARBs的临床应用提供一定的动物实验依据,为探索DN的发病机制、开发新药提供部分实验依据。[方法]1、糖尿病大鼠模型的制备和分组同第一章。2、厄贝沙坦、肼屈嗪灌胃给药同第一章。3、标本的留取给药8周后,大鼠麻醉,经腹主动脉4℃PBS灌注后取肾脏,肾脏纵向剖开后,切取约0.5×0.5×0.2cm3大小的组织,置于10%中性甲醛缓冲溶液中固定,剩余组织于冻存管中液氮冻存。5、肾α3整合素、p1整合素mRNA的测定：Trizol法提取肾皮质(液氮中冻存组织)总RNA。Real time RT-PCR检测肾皮质α3整合素、β1整合素mRNA表达情况,以GAPDH作为内参。6、肾脏局部AngⅡ的检测：从液氮中取出冻存的肾组织(肾皮质)移入1.5ml的EP管中,用冰浴的0.9%生理盐水冲洗后剪碎,加入1mL0.1 mol/L的冰醋酸中,4℃下用匀浆器制成匀浆,95℃水浴10min,冷却后4℃,15000rmp,离心20 min,吸取上清液于EP管。按大鼠血管紧张素ⅡELISA试剂盒说明书进行操作。7、统计方法所有数据由SPSS13.0统计软件处理,以均数±标准差(x±SD)表示,符合正态分布和方差齐性时用单因素方差分析(ONE-WAYANOVA),进一步组间多重比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。变量相关分析时,采用person相关分析和偏相关分析。[结果]1、厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏局部血管紧张素Ⅱ的影响糖尿病对照组大鼠肾脏AngⅡ水平较正常对照组大鼠显著升高(P<0.001),不同剂量厄贝沙坦干预后,糖尿病大鼠肾脏AngⅡ水平显著低于糖尿病对照组大鼠(P均<0.001)；200mg／kg.d厄贝沙坦干预组显著低于25mg／kg.d和50mg／kg.d厄贝沙坦干预组(P<0.05)；25mg／kg.d厄贝沙坦干预组(P<0.001)和50mg／kkg.d厄贝沙坦干预组组间无显著差异(P>0.05)。肼屈嗪干预后,该组糖尿病大鼠肾脏AnglⅡ水平显著低于糖尿病对照组大鼠(P<0.001),与25mg／kg.d和50mg／kg.d厄贝沙坦干预组相比无显著差异(P>0.05),但显著高于200mg／kg-d厄贝沙坦干预组(P<0.01)。2、厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏α3β1整合素mRNA的影响2.1、厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏α3整合素mRNA的影响糖尿病对照组大鼠肾脏α3整合素mRNA的表达较正常对照组显著降低(P<0.001)。肼屈嗪干预后,糖尿病大鼠较糖尿病对照组显著升高(P<0.001)。不同剂量厄贝沙坦干预后,其表达较糖尿病对照组显著升高(P均<0.01)；200mg／kg.d厄贝沙坦干预组显著高于25mg／kg.d厄贝沙坦干预组(P<0.001)和50mg／kg.d厄贝沙坦干预组(P<0.01),与肼屈嗪干预组相比无显著差异(P>0.05)。2.2、厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏β1整合素mRNA的影响糖尿病对照组大鼠肾β1整合素mRNA的表达较正常对照组显著降低(P<0.001)。在肼屈嗪干预后,该组糖尿病大鼠肾β1整合素mRNA的表达较糖尿病对照组显著升高(P<0.001)。予不同剂量厄贝沙坦干预后,200mg／kg.d、50mg／kg.d厄贝沙坦干预组较糖尿病对照组显著升高(P均<0.05)；200mg／kg.d厄贝沙坦干预组显著高于50mg／kg.d厄贝沙坦干预组(P<0.001)和25mg／kg.d厄贝沙坦干预组(P<0.001),但与肼屈嗪干预组相比无显著差异(P>0.05)；25mg／kg.d厄贝沙坦干预组和50mg／kg.d厄贝沙坦干预组两组间无显著差异(P>0.05)。2.3糖尿病大鼠肾脏局部AngⅡ水平与肾脏a3β1整合素mRNA的表达相关分析。3、相关分析3.1肾小球足细胞密度与肾脏α3、β1整合素mRNA表达的关系肾小球足细胞密度与肾α3、β1整合素mRNA表达显著相关,Rα3=0.883、P<0.001；Rβ1=0.853、P<0.001。3.2肾脏局部AngⅡ水平及干预后动脉血压与肾脏α3、β1整合素mRNA表达的相关关系剔除血压影响,肾脏局部AngⅡ水平与肾α3、p1整合素mRNA表达显著相关,Rα3=—0.527、P<0.001,Rβ1=—0.421、P<0.001。剔除干预前血压及肾脏局部AnglⅡ水平,干预后动脉血压与肾α3、β1整合素mRNA的表达无显著相关,Rα3=—0.183、Rβ1=—0.263、P均>0.05。[结论]1、糖尿病大鼠肾脏局部RAS系统激活,局部AngⅡ水平显著升高,与既往研究一致。厄贝沙坦干预后显著改善,与剂量相关。2、糖尿病大鼠肾脏α3p1整合素表达的下调,可能是导致足细胞丢失的重要原因。3、厄贝沙坦在降压外,可能通过下调肾脏局部AngⅡ水平,改善肾α3、β1整合素mRNA的表达。