目的：　　中性粒细胞被激活后，其核DNA与胞浆颗粒蛋白一起形成纤维网状结构，即中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps,NETs），此过程称为“NETosis”。传统观点认为，NETs可以捕获病原微生物，在固有免疫反应中具有重要意义。然而，最新研究显示，在糖尿病过程中，NETosis会持续存在，释放的NETs阻碍伤口愈合。此外，流行病学资料显示，多种肿瘤在糖尿病时发病率也明显升高，那么NETs是否参与糖尿病时肿瘤的发生呢？目前尚未见报道。另外，本实验室长期以来一直从事硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）的相关研究，其通过减少活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）的生成可发挥明显的抗氧化效应，而ROS在NETosis发生过程中起着重要作用。那么H2S能否通过减少ROS生成抑制NETosis发生进而促进伤口愈合呢？基于此，本文的研究目的是：　　1.明确糖尿病足部溃疡患者体内NETs水平；　　2.建立NETosis体外模型，收集NETs并用其处理肿瘤细胞，观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响；　　3.观察H2S对糖尿病伤口愈合障碍的影响，探讨其机制是否与抑制NETosis有关。　　方法：　　1.分别收集糖尿病足溃疡患者和健康志愿者外周血5例，分离血清，检测dsNDA和中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)的活性，观察糖尿病足溃疡患者血清中NETs成分的含量。　　2.分离健康志愿者外周血中性粒细胞，瑞氏-吉姆萨染色后在显微镜下初步观察分离细胞的形态，进一步用APC CD11b抗体标记分离的细胞，流式细胞分析术分析中性粒细胞的纯度。　　3.佛波酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）刺激中性粒细胞，建立NETosis体外模型。Western blot法检测NETosis相关蛋白精氨酸脱亚胺酶4（Peptidylarginine Deiminase4,PAD-4）和瓜氨酸化组蛋白3（Citrulline Histone3,Cit-H3）的表达情况，明确PMA诱导NETosis形成的最适浓度和最佳时间。　　4.用25nM PMA刺激中性粒细胞2h，差速离心法提取培养皿底部NETs，通过Western blot法检测髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）、基质金属蛋白酶9（Matrix Metalloproteinase9,MMP-9）以及NE，并用PicoGreen检测dsDNA含量，从而对提取物进行鉴定。　　5.将提取的NETs与几种常见肿瘤细胞（肝癌细胞SMMC7721、肺癌细胞A549、宫颈癌细胞Hela）共培养48h后。采用CCK-8法检测细胞活力，观察NETs对肿瘤细胞增殖能力的影响；NETs与肿瘤细胞共培养后用胰酶消化，接种于96孔板，分别检测总细胞和6h后贴壁细胞数目，计算细胞粘附率；将不同浓度的NETs置于Transwell板下室，与上室的肿瘤细胞共培养48h，0.5%结晶紫染色后用显微镜观察NETs对肿瘤细胞迁移能力的影响。　　6.在小鼠背部制作直径为6mm的全层皮肤伤口，测量计算小鼠伤口面积，Western blot法检测伤口组织NETosis和NETs相关蛋白的表达，探讨NETosis对糖尿病小鼠伤口愈合的影响。腹腔注射H2S（以Na2S为供体），通过检测皮肤伤口面积以及伤口组织dsDNA含量和NE活性，探讨H2S促进糖尿病小鼠伤口愈合是否与抑制NETosis有关。　　7.分离中性粒细胞，25μMH2S预处理1h后再给予25nM PMA刺激2h，通过核酸染色从形态上初步观察H2S对PMA诱导的NETs释放的影响，进一步检测培养皿底部NETs成分（dsDNA含量、NE和MPO活性）的变化。通过二氢罗丹明123检测ROS的含量。最后，通过检测NETosis相关蛋白PAD-4和Cit-H3的表达，明确H2S对抗PMA诱导的NETs释放是否与抑制NETosis有关。　　结果：　　1.糖尿病足溃疡患者血清dsDNA含量明显高于健康志愿者（P＜0.01），其NE活性也高于健康志愿者（P＜0.05）。　　2.对分离细胞用瑞士-吉姆萨染色后在显微镜下观察显示，细胞主要为分叶核；流式细胞术定量分析显示，APC CD11b阳性率为99.95%。结果提示分离得到的细胞以中性粒细胞为主，并且中性粒细胞含量大于95%。　　3.不同浓度PMA处理中性粒细胞后，PMA浓度为25nM时PAD-4和Cit-H3表达达到峰值。在2h内，随着处理时间延长，PAD-4和Cit-H3的表达时间依赖性升高。通过Western blot法检测提取物显示，提取物中含有dsDNA、MPO、MMP-9和NE，而且MPO和NE具有催化活性。　　4.用不同浓度的NETs处理糖尿病过程中常见的三种癌细胞，检测细胞活力显示，低浓度（0.13μg/ml）NETs处理48h可诱导肝癌细胞SMMC7721增殖，而对另外两种细胞无明显影响。进一步检测NETs对SMMC7721细胞粘附和迁移能力的影响，结果显示，NETs可明显增强SMMC7721细胞的粘附和迁移功能（P＜0.05）；当NETs浓度过高时，对各种肿瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用，也能明显抑制肝癌细胞SMMC7721的粘附能力和迁移能力（P＜0.05）。　　5.通过观察伤口的愈合状况发现，糖尿病小鼠伤口愈合率明显低于对照组（P＜0.01）；另外，糖尿病小鼠伤口组织NETosis相关蛋白PAD-4和Cit-H3表达明显高于对照组，NETs成分MPO和NE也高于对照组。重要的是，给予H2S治疗后，糖尿病小鼠皮肤伤口愈合率明显高于模型组（P＜0.01）；并且皮肤伤口组织dsDNA含量减少（P＜0.05），并且NE活性降低（P＜0.05）。　　6.在PMA诱导的NETosis体外模型发现，PMA可促进纤维网状dsDNA释放，上调NE和MPO活性（P＜0.05），以及ROS释放（P＜0.05），促进NETosis相关蛋白PAD-4和Cit-H3的表达（P＜0.05）。重要的是，H2S预处理1h，PMA诱导网状结构消失，NE和MPO活性降低（P＜0.05），ROS含量减少，并且NETosis相关蛋白PAD-4和Cit-H3的表达也减少（P＜0.05）。　　结论：　　本研究证实，糖尿病可致中性粒细胞释放NETs，这些NETs可促进肝癌细胞增殖、粘附和迁移，阻碍糖尿病伤口愈合。H2S处理可抑制NETosis的发生和NETs释放，从而改善糖尿病伤口愈合。本研究为以NETs为靶点的糖尿病皮肤并发症和肝癌发生提供了新的治疗思路。