1研究设想乙肝慢性化机制与T淋巴细胞亚群的低反应性、NK活性降低、Th1类细胞因子水平下降等免疫功能不全、体内高滴度病毒含量及对感染细胞的免疫耐受状态有关。目前尚未发现根除HBV的药物，尚未明确HBV免疫耐受发生在哪一个应答环节或关键步骤上。中药复方对慢性乙型肝炎机体免疫功能表现出良好的调节作用，并能有效地促进HBV的清除。从CHB病毒水平与机体免疫状念二者的相关性入手，运用中药复方（疏肝健脾补肾方）对CHB患者、HBV转基因小鼠进行抗病毒和免疫调节作用研究目前尚未见报道。2研究目的本课题观察疏肝健脾补肾方联合ADV治疗CHB患者前后病毒DNA水平与免疫功能的相关性，进行抗病毒、免疫调节和中西医结合疗效研究，为防治CHB提供新思路和实验依据。以体外细胞模型来探讨中药抑制HBV复制的机理和意义。并在以往研究基础上观察疏肝健脾补肾方对HBV转基因小鼠的抗病毒和免疫调节作用，探讨中医药治疗HBV的疗效及作用机制。3研究方法3．1疏肝健脾补肾方对慢性乙型肝炎患者的免疫学调节机制51例肝郁脾虚兼脾肾阳虚型CHB患者按随机数字分成A、B、C三组。A为疏肝健脾补肾方组；B为疏肝健脾补肾方+ADV组；C为ADV对照组，每组各17例。A组患者在对症护肝的基础上，服用疏肝健脾补肾方，6个月为1用药疗程；B组患者在对症护肝的基础上，服用疏肝健脾补肾方和ADV；C组患者在对症护肝的基础上，服用ADV。治疗前、治疗后6个月均检测肝功能、免疫功能和病毒学指标。观察CHB患者的临床症状和体征；在自动生化仪上用常规的生化方法检测血清ALT、AST、STB、A／G等指标；采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA，乙肝两对半ELASA法检测HBsAg、HBeAg、抗-HBe；流式细胞仪免疫荧光法检测外周血T淋巴细胞亚群百分率、自然杀伤细胞；放免法检测血清IL-2。3．2疏肝健脾补肾方体外抗乙肝病毒的实验用2.2.15细胞作为体外模型，将疏肝健脾补肾方药物原液倍比稀释成7个浓度上药，同时设无药物细胞组进行对照。上药8天后收集上清用ELISA法测定HBsAg、HBeAg。MTT法检测药物细胞毒性，并计算药物对抗原的半数抑制浓度(IC₅₀)及治疗指数（TI）。3．3疏肝健脾补肾方对小鼠的急性毒性实验实验前把BALB／C小鼠随机分为6组，疏肝健脾补肾方160g／kg／d组、80g／kg／d组、40g／kg／d组、20g／kg／d组、10g／kg／d组和正常对照组（等量生理盐水），每组10只。以确定不同浓度的疏肝健脾补肾方安全剂量范围。动物禁食16h后一次性灌胃给予受试药物，观察5d，逐日记录中毒症状、死亡情况，死亡动物应及时尸解，记录病变情况，肉眼观察其病变组织。给药后同时观察动物死亡数、耸毛、蜷卧、耳廓苍白或充血、突眼、步履蹒跚、大小便、瘫痪、昏迷、抽搐、步态、呼吸困难等情况。最后断头处死所有动物。3．4疏肝健脾补肾方对HBV转基因小鼠免疫病理的干预作用实验动物共分为6组。正常对照组为6-8周龄非HBV转基因雄性BALB／C小鼠10只，灌以等量灭菌等渗生理盐水；SPF级HBV转基因雄性小鼠50只，HbsAg均为阳性，随机分为以下5组：模型组（灌以等量灭菌等渗生理盐水）、疏肝健脾补肾方低剂量组（按10g克生药／kg体重／天灌胃）、疏肝健脾补肾方中剂量组（按20g克生药／kg体重／天灌胃）、疏肝健脾补肾方高剂量组（按40g克生药／kg体重／天灌胃）、ADV组（按50mg／kg体重／天灌胃ADV），每组10只。每天按时喂药，连续21d。采血前禁食12h，最后1次采血后处死动物。分别于给药前1天（T0）、给药第10天（T10）、给药第21天（T21）、停药后3天（P3）取血，离心取血清，-80℃冻存，用ELASA法检测血清HBsAg，荧光定量PCR法测定血清中HBV DNA。取脾，按常规制备脾单细胞悬液，上流式细胞仪用荧光标记抗体法测定脾T淋巴细胞亚群，用放免法测定脾培养上清中的IL-2、ELISA法测定脾培养上清中的IFNγ。取病变明显处的肝脏作病理学切片及HbcAg免疫组化。4研究结果4．1疏肝健脾补肾方对慢性乙型肝炎患者的免疫学调节机制B组在胁肋胀痛、腹胀便溏、畏寒肢冷、抑郁烦闷、身倦乏力、少腹腰膝冷痛等症状改善方面，优于其它二组。临床疗效方面，三组总有效率之间比较差异均无显著性意义。三组在ALT、AST、TSB、A／G等肝功能恢复方面效果均好，其中B组（疏肝健脾补肾方+ADV）ALT复常率高于单一中药、西药组。三组HBV DNA转阴率总体比较差异有显著性意义，以B组（疏肝健脾补肾方+ADV）转阴率最高。A组、B组、C组治疗前后HBV DNA含量差异有显著性意义，尤以B组为甚。上述结果提示，中西医联合用药比单一中药和单一西药抑制病毒复制的效果更好。三种治法均可增加CD3⁺、CD4⁺百分比，减少CD8⁺细胞百分比，尤以A组、B组增加CD3⁺细胞、A组增加CD4⁺细胞、B组减少CD8⁺细胞的效果更为显著。而ADV单用时增加CD3⁺、CD4⁺和减少CD8⁺的作用则较弱。B组可同时非常显著性提高NK细胞活性和IL-2分泌；C组仅对NK细胞有正向激活作用，对IL-2则无显著影响；相反，A组对NK细胞活性影响不显著，对IL-2水平则有显著提升作用。B组治疗前后CD3⁺百分比的增加、NK细胞的增加、CD8⁺百分比的减少与HBV DNA载量的减少呈显著正相关。A组治疗前后CD4⁺百分比的增加与HBV DNA载量减少呈显著正相关。B组、C组患者各1例偶见药物不良反应。4．2疏肝健脾补肾方体外抗乙肝病毒的实验疏肝健脾补肾方对2．2．15细胞的半数毒性浓度TC₅₀为30.28mg／ml，对2．2．15细胞分泌的HBsAg、HBeAg半数抑制浓度为25.96 mg／ml、36.46 mg／ml，治疗指数分别为1.17、0.83。说明疏肝健脾补肾方能低效抑制细胞表达HBsAg，且有毒性作用，而无抑制HBeAg抗原的作用。4．3疏肝健脾补肾方对小鼠的急性毒性实验疏肝健脾补肾方160g／kg／d组显示出一定的不良反应。从第2天开始均表现出纳差、饮水量少、乏力、行动迟缓、蜷卧、大便溏泄等情况。在第4天死亡1只，在第5天死亡2只。经解剖发现肝脏呈暗红色，胃肠肿胀并扭曲。可能由于药物的浓度太大，引起小鼠肝脏水肿、出血、坏死所致。而疏肝健脾补肾方80g／kg／d组、40g／kg／d组、20g／kg／d组、10g／kg／d组给药后动物一般状况良好，未发现明显的毒性反应，未见动物死亡。因此，本课题实验所用剂量均在80g／kg／d以下范围进行。4．4疏肝健脾补肾方对HBV转基因小鼠免疫病理的干预作用疏肝健脾补肾方中、大剂量及ADV组HBV Tg鼠血清HBsAg转阴率分别在给药后第10天、第21天、停药后第3天进行比较，差异均无显著性意义。ADV具有较好的减少HBV Tg鼠血清HBV DNA载量的作用，但停药后3天有反跳。疏肝健脾补肾方大、中剂量组均具有降低HBV Tg血清HBV DNA载量的作用，尤其以大剂量效果明显，虽然没有减少到ADV组的水平，但治疗前后差异有显著性意义，且停药后无明显反跳，说明中药作用持久、平稳。模型组Tg鼠肝脏病理改变类似临床轻度肝炎表现，随着中药疏肝健脾补肾方浓度的增大，炎症得以缓解，大剂量组的肝板排列整齐，淋巴细胞浸润程度减轻。而ADV治疗小鼠肝组织汇管内见散在的淋巴细胞浸润，无纤维组织增生，但中央静脉周围肝细胞轻度脂肪变性。疏肝健脾补肾方中、大剂量和ADV均能减少肝组织中HbcAg表达，尤其以大剂量明显。疏肝健脾补肾中药能够上调HBV转基因小鼠CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺／CD8⁺，下调CD8⁺T细胞比值水平，具有正向T淋巴细胞免疫调节作用，尤其以大剂量组效果更为显著。ADV也具有提高HBV转基因小鼠细胞免疫的功能（如CD3⁺百分比），但作用相对中药较弱。运用大、中、小剂量疏肝健脾补肾方和ADV均能提高HBV转基因小鼠血清IL-2、IFN-γ含量，与模型组相比差异有显著性意义。且运用大剂量和中剂量的疏肝健脾补肾方治疗后IL-2、IFN-γ水平已高于正常对照组。疏肝健脾补肾方中剂量组CD3⁺、IFN-γ与给药前后HBV DNA载量的减少呈显著正相关，疏肝健脾补肾方大剂量组CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺／CD8⁺与给药前后HBV DNA载量减少呈显著正相关。5结论1、疏肝健脾补肾方是较好的免疫调节剂，能明显地增强Th1类细胞因子的分泌，使低下的免疫功能得到改善。2、疏肝健脾补肾方通过对机体免疫功能的调节，进而抑制HBV复制，这符合中医的“扶正”以“祛邪”理论。3、ADV具有较好的减少体内血清HBV DNA载量的作用，而疏肝健脾补肾方调节机体免疫功能强于ADV。中西医结合用药能明显改善CHB患者临床症状，具有抗病毒、免疫调节等整体功能。