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目的原发性肝癌(下称肝癌)是严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤之一。根据现有认识，病毒性肝炎、黄曲霉毒素和饮水污染是公认的肝癌三大相关因素，而这些因素可以导致体内长期慢性炎症的过程，从而有利于肿瘤的发生和发展。肿瘤能在人体内发生并持续发展，通常都伴随着宿主的免疫抑制。肿瘤有多种机制逃避体内的免疫监视，其中一个重要的机制就是分泌一些细胞因子例如TGF-β1、VEGF、IL-6等来抑制DC细胞的成熟和消弱T细胞的CTL作用，从而达到免疫耐受。然而，肿瘤细胞分泌免疫抑制细胞因子的机制尚不清楚。Toll样受体4(TLR4)是新近发现的天然免疫受体，它是一类模式识别受体，能够被微生物的特异性成分和某些宿主分子所激活，它们构成了防御很多病原体的第一道防线，在天然免疫系统中起着决定性的作用。目前研究表明脂多糖(LPS)和热休克蛋白70(HSP70)分别是TLR4的外源性和内源性配体。对TLR4受体传导通路的研究表明TLR4受体传导通路可以激活核因子KB(NF-κB)，从而调解一些前炎性细胞因子的分泌。而这些细胞因子参与了肿瘤发生和发展，提示TLR4可能影响肿瘤的生长。最近的研究表明TLR4在许多肿瘤细胞表面均有表达，但是TLR4在肝癌细胞表面是否表达，TLR4的作用机制如何还不清楚。本研究我们首先研究肝癌细胞株HepG-2表面TLR4表达的情况，然后研究LPS刺激前后细胞因子分泌的改变情况，探讨TLR4的信号传导活化途径，最后研究TLR4内源性配体HSP70的作用途径。方法1．分别利用RT-RCR和Western-blot方法检测肝癌细胞株HepG-2细胞TLR4mRNA和TLR4蛋白的表达情况。2．利用免疫组化的方法观察TLR4受体在肝癌组织中的表达情况。3．利用RT-PCR和Western-blot方法分别检测和对比LPS刺激前后肝癌细胞株HepG-2中TGF-β1，VEGF，IL-6 mRNA和蛋白的表达情况。然后检测阻断TLR4受体后LPS刺激肝癌细胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF，IL-6 mRNA和蛋白的表达情况。4．利用RT-PCR和Western-blot方法分别检测和对比LPS刺激前后肝癌细胞株HepG-2中NF-κB mRNA和蛋白的表达情况。然后检测阻断TLR4受体后LPS刺激肝癌细胞株HepG-2后NF-κB mRNA和蛋白的表达情况。5．HSP70-肿瘤肽复合物的纯化：肝癌组织应用裂解液进行匀浆，并高速离心制备总蛋白。上述的总蛋白依次进行ConA-Sepharose亲和层析和DEAE-Sephacel离子交换层析分离纯化。所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行蛋白分子量及性质鉴定，Bradford法测定蛋白浓度。6．利用RT-PCR和Western-blot方法分别检测和对比HSP70-肿瘤肽复合物刺激前后肝癌细胞株HepG-2中TGF-β1，VEGF IL-6 mRNA和蛋白的表达情况。然后检测阻断TLR4受体后HSP70-肿瘤肽复合物刺激肝癌细胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF，IL-6 mRNA和蛋白的表达情况。7．利用RT-PCR和Western-blot方法分别检测和对比HSP70-肿瘤肽复合物刺激前后肝癌细胞株HepG-2中NF-κB mRNA和蛋白的表达情况。然后检测阻断TLR4受体后HSP70-肿瘤肽复合物刺激肝癌细胞株HepG-2后NF-κB mRNA和蛋白的表达情况。结果1．利用RT-PCR可以检测到肝癌细胞株HepG-2有TLR4 mRNA的表达；利用Western-blot可以检测到肝癌细胞株HepG-2有TLR4蛋白的表达。2．利用免疫组化表明肝癌组织中有TLR4的表达，其表达于细胞的细胞膜上，细胞浆中也可以有少量的表达，其阳性率约为76.7％(23/30)。3．LPS刺激肝癌细胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF，IL-6 mRNA和蛋白的表达均增加，而阻断TLR4受体后TGF-β1，VEGF，IL-6 mRNA和蛋白又下降。4．LPS刺激肝癌细胞株HepG-2后NF-κB mRNA和蛋白的表达均增加，而阻断TLR4受体后NF-κB mRNA和蛋白又下降。5．分离、纯化得到的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯量蓝鉴定为单一带，分子量为70kD；Western blot结果证实为HSP70。每10g组织最终获得8mg的HSP70。6．HSP70肿瘤肽复合物刺激肝癌细胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF，IL-6 mRNA和蛋白的表达均增加，而阻断TLR4受体后TGF-β1，VEGF，IL-6 mRNA和蛋白又下降。7．HSP70肿瘤肽复合物刺激肝癌细胞株HepG-2后NF-κB mRNA和蛋白的表达均增加，而阻断TLR4受体后NF-κB mRNA和蛋白又下降。结论1．肝细胞癌细胞株表面及人肝癌组织有TLR4的表达。2．作为TLR4的外源性配体，LPS可以活化细胞内的NF-κB信号传导系统及促进细胞因子TGF-β1，VEGF，IL-6的表达。3．使用ConA亲和层析和阴离子交换蛋白亲和层析二步蛋白纯化法可获得高纯度HSP70肽复合物。4．作为TLR4的内源性配体，HSP70同样可以活化细胞内的NF-κB信号传导系统及促进细胞因子TGF-β1，VEGF，IL-6的表达。