脂肪酸去饱和酶-3(fatty acid desaturase 3, FAD3)基因编码n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,能够将n-6多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty aci ds, PUFAs)转化成n-3 PUFAs。本试验成功构建基因打靶载体pCSN2-hF AD3和具有切割活性的pCas-Guide-1载体。利用CRISPR/Cas9技术将hFAD3基因定点整合到CSN2位点,研究hFAD3基因在乳腺细胞中特异表达,及其对脂肪酸相关基因表达的影响。结果表明,(1)外源基因已定点整合到了CSN2靶位点。(2)实时定量PCR检测hFAD3基因在转染后乳腺细胞和成纤维细胞中的表达结果显示,乳腺细胞中hFAD3基因的表达量为成纤维细胞中的2.5倍(P<0.01),说明hFAD3基因的表达具有一定的乳腺特异性。(3)脂肪酸含量分析结果显示,转染后细胞n-6/n-3比值较对照细胞显著下降(P<0.01)。(4)脂肪酸相关基因的表达检测结果显示,两种细胞中脂肪分解相关基因(LPL、LIPE和PPARg)表达量大于脂肪合成相关基因(FASN、ACC和SCD)。(5)通过流式分选法及无限稀释法筛选单克隆细胞,经PCR鉴定和测序分析,共得到7株定点整合阳性细胞株。并检测单克隆细胞中脂肪酸含量变化和脂肪酸相关基因表达,结果与转染后细胞中的结果一致。上述结果表明,利用内源性p-酪蛋白启动子可以实现hFAD3基因在细胞水平良好表达,为生产乳腺特异表达hFAD3基因牛提供实验数据。