研究背景:随着糖尿病治疗水平的提高和糖尿病病人寿命的增加,人们逐渐认识到糖尿病(DM)性阴茎勃起功能障碍(ED)已严重影响生活质量,性生活的不满足感、性功能障碍已成为影响病人生活质量的一个重要问题,即使在矫正年龄、性别、影响生活质量的其他变量后,性问题仍然对生存质量有重大的影响。ED的诊断和治疗已引起临床专家的重视,ED的治疗可提高患者的生存质量。但目前对糖尿病性ED的机制研究相对滞后,影响了DM性ED的治疗效果。目前,增龄对于男性勃起功能障碍的影响已经得到临床证实。作为糖尿病一种常见的并发症,勃起功能障碍也已经被临床证实。但是,增龄与糖尿病性阴茎勃起功能障碍的机制仍不十分难清楚,增龄与糖尿病对勃起功能障碍的协同影响,也尚待我们进一步研究。缝隙连接(gap junction),又称间隙连接,是由连接相邻两个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构。相邻细胞间通过缝隙连接所介导的细胞间隙连接通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)进行着信息、能量和物质的交换,参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联,对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用。阴茎海绵体平滑肌细胞间隙连接的主要成分是连接蛋白43(CX43),CX43通过电偶联与代谢偶联将众多的阴茎海绵体平滑肌细胞联结成一功能性的整体,可协调诸多平滑肌细胞之间的同步舒张,对诱导阴茎海绵体平滑肌松弛与维持勃起有重要的作用。我们通过研究增龄与糖尿病对大鼠勃起功能的影响,探讨在DM性与老龄性ED的发病机制,为DM性和老龄性ED的治疗提供理论依据。第一部分增龄性阴茎勃起功能的机制研究目的:建立大鼠增龄模型,观察增龄对大鼠阴茎勃起功能的影响。方法:1、3月龄、9月龄、18月龄实验动物,每组10只。于饲养1周后,每只大鼠注射阿朴吗啡(APO,80μg/kg)后观察各组大鼠阴茎有无勃起、阴茎勃起次数。龟头充血及末端阴茎体出现为阴茎勃起一次。2、取3月龄,9月龄、18月龄大鼠的阴茎根部白膜下海绵体组织,超薄切片(厚约70nm),枸椽酸铅染色,在TEM-1 200EX透射电镜下观察。3、应用Realtime PCR、western blot方法检测高龄大鼠与低龄大鼠阴茎海绵体缝隙连接蛋白43(CX43)表达结果:1、老年大鼠在勃起次数及勃起率方面较青年大鼠明显下降,两组相比差异有显著统计学意义(勃起次数)或极显著意义(勃起率)(表1)。2、随大鼠增龄内皮细胞及平滑肌细胞出现细胞排列紊乱、分离,其之间间质组织增多,分布不均匀,线粒体数量增多但结构紊乱,线粒体嵴减少,线粒体肿胀,空泡增多等改变。3、Real-time PCR检测CX43基因表达结果:随着年龄的增长,大鼠阴茎海绵体组织CX43的表达逐渐降低,揭示老年性大鼠阴茎勃起功能障碍与大鼠阴茎海绵体CX43表达减少密切相关。4、Western blot检测结果显示,CX43蛋白表达随年龄增加逐渐减少。结论:1、老年大鼠阴茎勃起率、阴茎勃起次数明显低于低龄大鼠,说明增龄明显降低大鼠阴茎勃起功能。2、老年大鼠茎海绵体组织CX43的表达明显低于青年大鼠,揭示增龄性大鼠阴茎勃起功能障碍与大鼠阴茎海绵体CX43表达减少密切相关。第二部分糖尿病性大鼠阴茎勃起功能的机制研究目的:研究糖尿病对阴茎勃起功能障碍的影响机制。方法:1、建立DM动物模型。实验动物分为实验组40只(其中包括糖尿病模型组20只,模型治疗组20只),对照组20只。12周后注射阿朴吗啡(APO,80μg/kg)后观察三组大鼠阴茎有无勃起、阴茎勃起次数。龟头充血及末端阴茎体出现为阴茎勃起一次。2、将实验大鼠于12周末断颈处死,解剖分离出阴茎组织。取阴茎根部白膜下海绵体组织超薄切片(厚约70nm),枸椽酸铅染色,在TEM-1 200EX透射电镜下观察。3、应用Realtime PCR、western blot方法检测各组大鼠阴茎海绵体缝隙连接蛋白43(CX43)表达。结果:1、在勃起次数及勃起率方面,糖尿病组与治疗组大鼠明显下降,与对照组相比差异有显著统计学意义(勃起次数)或极显著意义(勃起率)。2、糖尿病模型组与模型治疗组大鼠阴茎组织超微结构较对照组改变明显。两组糖尿病性ED组有明显差异,模型组内皮细胞破损以及平滑肌改变较模型治疗组明显。3、糖尿病模型大鼠阴茎海绵体组织CX43基因的表达最低,治疗组优于模型组(P＜0.001),二者均显著低于对照组(P＜0.001)。4、Western blot结果显示,与Real-time PCR结果相同,CX43蛋白表达在治疗组高于糖尿病组。结论:1、CX43基因及蛋白表达的减低,是糖尿病引起阴茎勃起障碍的重要机制。2、胰岛素治疗对改善大鼠阴茎海绵体CX43的表达具有重要作用第三部分增龄与糖尿病对阴茎勃起功能的协同影响目的:研究增龄与糖尿病对大鼠阴茎勃起功能的协同影响。方法:1、3月龄和18月龄实验动物分别随机分为两组,每组分为实验组40只(其中包括糖尿病模型组20只,模型治疗组20只),对照组20只。12周后注射阿朴吗啡(APO,80μg/kg)后观察各组大鼠阴茎有无勃起、阴茎勃起次数。龟头充血及末端阴茎体出现为阴茎勃起一次。3、将两组大鼠分别于12周末断颈处死,解剖分离出阴茎组织。枸椽酸铅染色,在TEM-1 200EX透射电镜下观察。4、分别应用Realtime PCR、Western blot方法检测各组大鼠阴茎海绵体缝隙连接蛋白43(CX43)表达。结果:1、糖尿病对不同月龄大鼠的影响(1)在勃起次数及勃起率方面,在月龄相同的情况下,模型组与对照组,治疗组与对照组间相比差异有显著统计学意义。(2)在6月龄大鼠组,糖尿病模型组与模型治疗组大鼠阴茎组织超微结构较对照组改变明显,糖尿病模型组与模型治疗组两组之间亦明显差异。在21月龄大鼠组,糖尿病模型组与模型治疗组大鼠阴茎组织超微结构较对照组改变明显,糖尿病模型组与模型治疗组两组之间无明显差异。(3)real-time PCR结果在6月龄组,对照组Ct值为22.5±2.3,治疗组为25.9±1.3,DM模型组为28.1±2.7,三组间有统计学差别,P值为0.001,各组间两两比较时,DM模型组与对照组,治疗组与对照组间的差别具有统计学意义,P值分别为0.001,0.001,但DM模型组与治疗组间的差别也具有统计学意义,其P值为0.018。在21月组,对照组Ct值为23.6±3.5,治疗组为24.6±2.6,DM模型组为25.1±3.2,三组间有统计学差别,P值为0.001,各组间两两比较时,DM模型组与对照组,治疗组与对照组间的差别具有统计学意义,P值分别为0.004,0.012,但DM模型组与治疗组间的差别没有统计学意义,其P值为0.316。3、Western blot结果显示,与Real-time PCR结果相同,CX43蛋白表达在6月龄组,对照组高于治疗组和DM模型组,DM治疗组高于DM模型组亦较明显。在21月组,对照组高于治疗组和DM模型组,DM治疗组与DM模型组之间表达差异不明显。2、增龄对糖尿病大鼠的影响(1)阴茎勃起的情况在勃起次数及勃起率方面,21月龄模型组大鼠明显下降,与6月组相比差异有显著统计学意义(勃起次数)或极显著意义(勃起率)。(2)real-time PCR结果,21月龄组糖尿病大鼠阴茎海绵体组织CX43的基因表达低于6月组。21月龄糖尿病治疗组大鼠阴茎海绵体组织CX43的基因表达亦低于6月组。(3)Western blot结果显示,与Real-time PCR结果相同,糖尿病模型及治疗组大鼠阴茎海绵体组织CX43蛋白表达随年龄增加均减低。结论:1.增龄与糖尿病均是引起勃起功能障碍的重要因素,二者具有协同作用;2.随着年龄的增加,胰岛素治疗对于糖尿病性勃起功能障碍的改善作用逐渐降低。