第一部分先天性肠无神经节细胞症神经标志物的表达特点小结目的:研究BMP2、BMP4、Ret、CXCR4、CR、GDNF、NSE、S-100、CAD、Bcl-2等几种神经节细胞标志物在先天性无神经节细胞症(HSCR)的表达特点,并探讨它们与先天性无神经节细胞症(HSCR)的病因相关性及临床诊断意义。方法:采用免疫组织化学法检测BMP2、BMP4、Ret、CXCR4、CR、GDNF、NSE、S-100、CAD、Bcl-2等几种神经标志物在45例HSCR(HSCR正常段、扩张段组、痉挛段组)、10例先天性巨结肠类源病(HAD)和10例对照组结肠壁的表达,并与常规HE染色进行对比分析。结果:HE染色扩张段肠壁神经丛中可见神经节细胞,痉挛段神经节细胞缺失;所有标志物的免疫组织化学染色与HE染色诊断结果一致。50%~70%的病例阳性表达BMP2、BMP4、Ret、CXCR4、GDNF等,90%以上病例表达CR、NSE、S-100、CAD等阳性,Bcl-2在正常对照组和发育较好的HSCR病例中不表达,在新生儿HSCR和巨结肠类缘病中表达阳性。结论:1)GDNF、BMP2、BMP 4、Ret、CXCR4等标志物通过激活不同的信号途径参与肠神经系统的发育,与部分HSCR的病因有关;2)Bcl-2只在发育不成熟的神经嵴细胞表达,可用于鉴别HSCR和HAD;3)CR、S-100和CAD联合免疫组化检查对HSCR的临床诊断价值较高,联合运用这些指标,对神经节细胞和神经纤维呈互补性阳性显色,可以增加诊断的准确性。第二部分儿童先天性肠无神经节细胞症的基因芯片检测及相关基因筛选目的:研究先天性肠无神经节细胞症患儿直结肠病变段(痉挛段)的全人类基因表达谱检测方法及结果分析,初步筛查小儿先天性肠无神经节细胞症的差异表达基因。方法:应用全基因表达谱芯片技术对6例先天性肠无神经节细胞症患儿直结肠病变段(痉挛段)和3例正常结肠组织进行全人类基因表达谱进行检测,根据检测结果所提供的火山图(Volcano Plots)、盒状图(Box Plot)、散点图(Scatter Plot)、聚类图(Heat Map and Hierarchical Clustering)、P值(P-value)、绝对差异倍数(Absolute Fold change)等方法分析所得结果,初步筛选出对小儿先天性肠无神经节细胞症有意义的差异表达基因,为下一步进行结果验证及分析研究筛选出目标基因。结果:在检测到的20000多个人类基因中,初步筛选出上调的差异表达基因共3850个,P-value值均<0.05,差异倍数均>2倍,P-value值0.01~0.05共154个,0.001~0.009之间共468个,0.0001~0.0009之间共834个,P-value值<0.0001共2394个基因;下调的差异表达基因共645个,P-value值均<0.05,差异倍数均>2倍,P值0.01~0.05共52个,0.001~0.009之间共111个,0.0001~0.0009之间共142个,P-value值<0.0001共321个基因。上调的与经典信号通道有关的基因共118个,P-value值<0.01,0.01~0.0001共48个,差异倍数均>2倍;P-value值<0.0001共70个,差异倍数均>2倍;下调的与经典信号通道有关的基因共11个,P-value值均<0.001,差异倍数均>2倍。结论:1)先天性肠无神经节细胞症发生病因非常复杂,常涉及多基因改变。2)基因表达谱芯片技术可同时产生大量的表达基因数据,利用多种技术对芯片产生的海量数据进行分析处理,可为先天性肠无神经节细胞症发病机理的研究提供一个全新的目标和方向,是一种快捷高效的研究手段。第三部分先天性肠无神经节细胞症患儿结肠组织中WNT5a、GLI-1、BMP7的表达特点研究目的:研究WNT5a、GLI-1、BMP7在先天性肠无神经节细胞症患儿正常段(吻合口)、扩张段、痉挛段中的表达和分布特点,验证芯片结果,并与正常结肠组织进行比较,探讨它们与先天性无神经节细胞症(HSCR)的病因相关性及分子生物学意义。方法:收集本院确诊为先天性肠无神经节细胞症的患儿手术时切除的结肠组织75例,外伤等非先天性肠无神经节细胞症患儿的正常结肠组织10例;采用免疫组织化学方法检测WNT5a、GLI-1、BMP7在75例HSCR(正常段、扩张段、痉挛段)和10例正常对照组的结肠壁的表达情况,并与常规HE染色进行对比分析;Western blotting检测WNT5a、GLI-1、BMP7蛋白在先天性肠无神经节细胞症患儿结肠组织不同部位的表达水平;q RT-PCR检测WNT5am RNA、GLI-1m RNA、BMP7 m RNA在先天性肠无神经节细胞症患儿结肠组织不同部位的表达水平;结果:1)HE染色,正常结肠和先天性肠无神经节细胞症的正常段、扩张段肠壁神经丛中可见神经节细胞,而病变的痉挛段则神经节细胞缺失。2)免疫组织化学方法检测显示,在有神经节细胞的正常结肠组织和先天性肠无神经节细胞症患儿结肠组织正常段、扩张段,WNT5a、GLI-1、BMP7均有表达。在缺乏神经节细胞的痉挛段,WNT5a、GLI-1、BMP7无明显表达。3)Western blotting检测显示,先天性肠无神经节细胞症结肠组织的痉挛段WNT5a、GLI-1、BMP7蛋白表达水平显著低于扩张段和正常段(P﹤0.01,n=75);4)q RT-PCR检测显示,先天性肠无神经节细胞症患儿结肠组织痉挛段WNT5am RNA、GLI-1m RNA、BMP7 m RNA显著低于扩张段和正常段(P﹤0.01,n=75),而扩张段与正常段两组间比较无明显统计学差异(P﹥0.05,n=75);结论:1)WNT5a、GLI-1、BMP7在先天性肠无神经节细胞症患儿结肠组织的正常段和扩张段中具有神经节细胞的部位表达,在病变的痉挛段中由于缺乏神经节细胞而表达水平显著降低。2)结果与基因芯片相吻合。3)这种表达的差异性可能与WNT5a、GLI-1、BMP7作为发育相关基因参与了先天性肠无神经节细胞症的发病有关,具体的分子生物学机制有待进一步研究证实。第四部分跨胎盘RNAi技术研究WNT5A质粒在小鼠肠无神经节细胞症发生过程中的作用机制研究目的:构建表达WNT5a基因RNA干扰片段的质粒,在Balb/C小鼠怀孕后不同时间窗(E8.5-E14.5)通过孕鼠尾静脉注射一定量的RNAi质粒下调WNT5a基因表达。研究Balb/C小鼠胚胎发育不同时期(E8.5-E14.5)WNT5a在肠道组织表达水平的变化特点和表达定位情况,探讨WNT5a对胎鼠消化道发育表现型的影响、在小鼠肠神经系统发育中的作用及其与先天性肠无神经节细胞症发病的相关性。方法:1)采用DNA重组技术将靶向的WNT5a基因的RNA干扰片段定向克隆到载体pc DNA6.2?-GW/Em GFP-mi R(Life,Catalog no.K4936-00)上,构建含有表达WNT5a基因的质粒,经过扩增、测序并验证;2)从胎肠开始发育的孕第8.5天起,在不同的时间点、以不同的浓度、注射体积、注射速度(注射时间)通过尾静脉向妊娠的Balb/C小鼠体内注射WNT5a基因RNA干扰质粒,下调WNT5a基因表达,获得靶基因WNT5a表达水平下调的子鼠;3)取注射质粒后48h胚胎和出生后2天小鼠处死,解剖取出整个消化道(从胃到直肠),分段(前肠、中肠、后肠)制备冰冻切片,免疫组化检测WNT5s及其下游基因的表达情况及肠神经系统的发育情况,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况;利用q RT-PCR检测WNT5s及其下游基因m RNA的表达情况;利用Western-blot检测WNT5s及其下游基因蛋白的表达情况。结果:1)成功构建表达WNT5a基因RNA干扰片段的穿梭质粒pc DNA6.2?-WNT5a 1、2、3、4以及阴性对照质粒pc DNA6.2?-scrambled,测序验证得出重组克隆中插入的片段序列与设计的寡聚单链DNA序列是一致的;2)妊娠Balb/C小鼠尾静脉注射WNT5a质粒后可以通过胎盘屏障,有效下调WNT5a基因在肠道组织表达;转染效果受质粒浓度、注射体积、注射速度(注射时间)以及孕鼠体重等影响;3)免疫组化检测显示干扰后子鼠后肠发育不良,神经节细胞缺失;q RT-PCR结果显示WNT5a m RNA在前肠和中肠的表达水平较后肠显著增高;Western-blot结果显示WNT5a蛋白的表达情况与q RT-PCR结果相一致;4)WNT5a下调后的胎鼠可见后肠发育不良,出生后小鼠解剖显示直肠发育差、结肠扩张的肠无神经节细胞表现。结论:1)成功构建出表达WNT5a基因RNA干扰片段的质粒并顺利进行跨胎盘RNAi研究,完善了RNAi技术平台;2)证实了WNT5a在肠神经系统的发育过程中起到重要作用,下调后可能抑制肠神经嵴干细胞在肠道中的迁移和定植,导致肠无神经节细胞症发生。