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目的:胚胎发育到受精后27小时左右的双细胞中期,其生命活动依然主要依赖于在卵母细胞中合成的各种蛋白质和RNA,因此卵母细胞的发育对受精卵的首次卵裂至关重要。哺乳动物卵母细胞在发育成熟过程中经历复杂的两次减数分裂过程。卵母细胞在第一次减数分裂前期的双线期受阻,此时的细胞核膨大,也称生发泡(germinal vesicle,GV)。在垂体性激素的刺激下,卵母细胞恢复减数分裂,表现为生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)。从GV到GVBD的过程与有丝分裂过程中的G2/M过渡高度相似,是卵母细胞成熟过程中的第一个重要事件,也是保证减数分裂完成和胚胎正常发育的关键过程。虽然已经有研究证实Akt参与小鼠卵母细胞成熟过程,但其上下游的分子机制仍需要进一步探索。蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB/Akt)作为一种Ser/Thr激酶,参与细胞多种生命活动。Akt活化的关键步骤是它的PH结构域与3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3)结合,并被介导转位至细胞膜发生磷酸化激活,而PIP3是PI3K信号途径受到生长因子等的刺激活化后催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇的产物。在过去的25年中,Akt信号领域有了深入的研究和发现,许多发现证实Akt与和人类健康和疾病有着重要的关系。我们之前的报道表明,Akt可能通过磷酸化的Cdc25B促进小鼠受精卵的细胞分裂,而Cdc25B是Cdc2的重要上游催化因子之一,Cdc2是组成成熟促进因子(Maturation promoting factor,MPF)的分子之一,在G2/M过渡过程中发挥重要作用。蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)也是Ser/Thr激酶,在许多细胞功能中对Akt有重要的调节作用,同时已有许多研究证明了PKC参与哺乳动物受精和受精卵发育的多种调控过程,但在小鼠卵母细胞发育过程中的作用及与Akt的关系还有待阐明。最近的报道显示钙调蛋白(Calmodulin,CaM)和PIP3可以一起结合Akt的PH结构域,协同促进钙信号传导。钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)是受Ca2+/钙调蛋白调控的一种Ser/Thr激酶。研究发现CaMKⅡ是钙和钙调蛋白在多种细胞中的G2/M转化过程中的作用靶点,但其在卵母细胞从GV到GVBD的减数分裂过程中作用机制尚不清楚。本研究使用qPCR,Western blotting和免疫荧光方法证明了pAkt1(Ser473)在卵母细胞双线期阻滞释放过程的表达和定位变化;随后使用pAkt1(Ser473)特异性抑制剂SH-6,PKC抑制剂Sotrastaurin和CaMKⅡ抑制剂KN-93分别处理细胞,通过Western blotting和免疫荧光方法检测pAkt1(Ser473),pPKCδ(Thr505),pCaMKⅡ(Thr286),Cdc25B和pCdc2(Tyr15)的表达和定位,初步探究了pAkt1(Ser473),pPKCδ(Thr505)和pCaMKⅡ(Thr286)在小鼠卵母细胞第一次减数分裂恢复过程中的作用和关系。研究方法:1、在本研究中,首先收集GV、GVBD、MⅡ期卵母细胞,应用qPCR检测Akt三种亚型在不同时期卵母细胞中的表达,Western blotting检测pAkt1(Ser473)和Cdc25B的蛋白表达变化;随后用pAkt1(Ser473)特异性抑制剂SH-6处理卵母细胞后,Western blotting和免疫细胞荧光染色法检测pAkt1(Ser473)和Cdc25B、pCdc2(Tyr15)的表达和定位变化,明确pAkt1(Ser473)在细胞从GV期到GVBD期的作用。2、使用PKC抑制剂Sotrastaurin处理细胞,比较处理组与对照组卵母细胞进入GVBD的百分比,同时检测pAkt1(Ser473),pPKCδ(Thr505),Cdc25B和pCdc2(Tyr15)表达和定位变化,明确pPKCδ(Thr505)对小鼠卵母细胞发育和pAkt1(Ser473)的作用。3、CaMKⅡ抑制剂KN-93分别处理细胞,统计卵母细胞进入GVBD的百分比,检测pAkt1(Ser473)表达和定位变化,同时使用SH-6培养细胞检测pCaMKⅡ(Thr286)的表达变化,明确pAkt1(Ser473)和pCaMKⅡ(Thr286)对小鼠卵母细胞发育及彼此间的相互作用。结果:1、qPCR结果显示GVBD期Akt1的mRNA水平高于GV和MⅡ期,与Western blotting检测结果相同;SH-6处理细胞后,GVBD百分比、pAkt1(Ser473)和Cdc25B水平下降,pCdc2(Tyr15)上升;免疫荧光显示处理组pAkt1(Ser473)、Cdc25B和pCdc2(Tyr15)定位改变。2、Sotrastaurin处理细胞后,GVBD百分比、pAkt1(Ser473)和Cdc25B水平下降,pCdc2(Tyr15)上升,而SH-6处理细胞pPKCδ(Thr505)水平无明显改变。3、KN-93处理组GVBD百分比、pAkt1(Ser473)水平下降,同时SH-6处理组pCaMKⅡ(Thr286)水平也下降;免疫荧光结果显示处理组蛋白定位较对照组有改变。结论:下调pAkt1(Ser473)抑制了Cdc25B表达,而且降低了pCdc2(Tyr15)的去磷酸化水平,同时也抑制了小鼠卵母细胞的双线期阻滞的释放;当pPKCδ(Thr505)受抑制时,磷酸化的Akt1(Ser473)显著下降,暗示pPKCδ(Thr505)可能是一个Akt1上游激酶;抑制pAkt1(Ser473)时pCaMKⅡ(Thr286)下降,同时抑制pCaMKⅡ(Thr286)时pAkt1(Ser473)及卵母细胞的双线期释放也受抑制,表明pAkt1(Ser473)和pCaMKⅡ(Thr286)在此过程中可能存在相互作用关系。