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基质金属蛋白酶家族(MMPs)是一类锌离子(Zn2+)和钙离子(Ca2+)依赖的肽链内切酶。MMPs通过降解细胞外基质(ECM)参与许多生理过程,包括生殖、发育、形态发生和组织重塑以及关节炎、心血管疾病和癌症转移在内的病理情况。基质金属蛋白酶26(MMP-26/endometase/matrilysin-2)是公认的乳腺癌、前列腺癌和其他上皮来源的癌症的生物标志物。MMP-26含有261个氨基酸,主要在胎盘和子宫中表达。MMP-26可以降解多种蛋白质,例如IV型胶原蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、玻连蛋白、变性胶原蛋白类型I-IV、胰岛素样生长因子。MMP-26在肿瘤细胞中的表达及其广泛的蛋白降解活性的研究,表明MMP-26在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。通过免疫学和蛋白质组学等方法发现在敲除MMP-26基因的细胞内热休克蛋白90、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、膜联蛋白V、原肌球蛋白和过氧氧化还原酶II等蛋白表达量明显上调,而α-微管蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA-III、β-肌动蛋白等蛋白表达量下调。这一现象为我们研究GRP78与MMP-26在细胞内的相互作用提供依据。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)又称为免疫球蛋白重链结合蛋(Immunoglobulin heavy chain binding protein,Bip)属于热休克蛋白70(Heat shock protein 70)家族中的一员。GRP78作为分子伴侣,主要功能是参与新合成蛋白质的跨膜迁移以及蛋白质的成熟、折叠和转运,抑制内质网中新合成蛋白质的聚集、调节内质网中钙离子的平衡等。GRP78在正常细胞中低表达或不表达,而在多种恶性肿瘤细胞,如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌和肺癌等癌症中呈高表达,提示我们GRP78的表达与肿瘤的发生和发展有重要的联系。同时研究发现:过表达GRP78的肿瘤组织对化疗药物有一定程度的耐药作用,而敲除GRP78基因后会明显降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药性,因此抑制其基因表达或抑制其功能可作为肿瘤治疗的一种方案。这提示我们可以以GRP78为靶点进行肿瘤治疗,为研究MMP-26与GRP78在体内体外的相互作用提供依据。首先,我们构建体外重组表达GRP78蛋白的重组基因p GEX-4T-1-GRP78,并将其入表达菌BL21(DE3)获得大量可溶表达的GRP78蛋白,并利用GST柱纯化获得GRP78-GST融合蛋白;同时体外重组表达获得cat MMP-26蛋白,因其以包涵体形式表达,通过透析复性恢复其天然构象和生物活性,并通过明胶酶谱法和荧光酶标仪检测复性后cat MMP-26蛋白的活性。随后通过免疫荧光化学实验,荧光显微镜观察发现,细胞内MMP-26与GRP78共同定位于内质网,为研究MMP-26蛋白与GRP78蛋白的相互作用奠定基础;同时利用GST pull down试验研究体外重组表达的GRP78-GFP融合蛋白对MMP-26蛋白的捕获作用证明MMP-26与GRP78在体外的相互作用;同时模拟人体温度37℃,通过免疫印迹试验分析发现体外MMP-26对GRP78蛋白有降解作用;利用GFP亲和层析纯化实验分离获得细胞内表达的MMP-26蛋白,同时获得细胞内与MMP-26有相互作用的GRP78蛋白,证明在细胞内MMP-26与GRP78之间存在相互作用;同时通过培养MMP-26和sh RNA MMP-26稳定表达的Hela细胞,证明细胞内MMP-26对GRP78的蛋白降解作用。综上所述,本论文证明了细胞内MMP-26与GRP78共定位于内质网;在体外及体外MMP-26与GRP78均有相互作用及MMP-26对GRP78的蛋白降解作用。至此研究发现MMP-26与GRP78在体内体外的相互作用,这将为探索MMP-26与GRP78在肿瘤中的作用奠定基础。