1.背景阿尔茨海默病(Alzeimer disease, AD)是老年痴呆症最常见的一种,以认知功能障碍为主要临床表现。现代医学研究表明,AD病因主要与β淀粉样蛋白(Amyloid β, Aβ)在脑组织异常沉积、Aβ清除障碍、胆碱能神经元受损、氧化应激反应、脑内炎症级联反应或基因突变等因素有关,为此研究者虽然针对改善胆碱能神经元功能、抗氧化应激等多方面研制了各种药物,但是目前尚未找到有效的治疗措施,尤其是仍未使脑损伤得以根本解决。然而,在中医理论知道下,本研究团队前期研究表明,AD隶属于中医“络病”范畴,“毒损脑络”是其病机关键,在临床中运用针对该病机关键的解毒通络法进行辨证论治取得了显著疗效。以脑微血管内皮细胞为主要物质基础的中医络脉系统具有渗灌气血、贯通营卫之功效,是经脉气血进行物质交换的场所。络脉瘀滞引发气血渗灌失常,营卫失和,卫气壅滞,郁而化热,进而损伤络脉。若发于脑部络脉则形成“毒损脑络”之病机。随着对该疾病认识的逐渐深入,研究人员日益认识到以脑微血管内皮细胞为主要物质基础的脑部络脉系统对脑损伤的保护作用,除了能够调节血管细胞生长迁移、基质降解、活化多种细胞受体、激活细胞内信号转导通路外,还能调节脑组织内特定物质的脑外转运,对维持脑组织内环境的平衡稳定具有重要的调节作用。2.目的本研究在中医络脉理论指导下,以脑部络脉系统的主要物质基础-脑微血管内皮细胞为切入点,以具有解毒通络功效的通络救脑注射液(TLJN)为干预药物,重点探讨在拟AD损伤的大鼠脑微血管内皮细胞上特定β淀粉样蛋白转运体的动态改变以及由此转运体介导的细胞内特定信号转导通路的变化,在揭示该转运体改变与内皮细胞损伤程度的同时,阐明TLJN与血管内皮保护生物效应之间的关系,从分子水平对该注射液作用内皮细胞的可能靶点进行科学诠释,为“毒损脑络”病机假说在阿尔茨海默病的确立以及TLJN的临床应用提供体外实验依据。3.方法本研究共分为四部分：第一部分：观察解毒通络药物对拟AD损伤大鼠脑组织的保护作用。第二部分：探讨拟AD损伤大鼠脑微血管内皮细胞与神经元损伤的时程变化及TLJN干预作用。第三部分：探讨Aβ1-42对β淀粉样蛋白转运体的影响以及TLJN干预作用。第四部分：探讨拟AD损伤的脑微血管内皮细胞内PI3K/Akt/Caspase-3信号转导通路变化及TLJN干预作用。具体实验方案为：第一部分：大鼠双侧海马注射凝聚态Aβ1-42拟建立AD损伤动物模型,动物实验分为五组,分别是control组(正常对照组)、sham组(假手术组),model组(模型组)、TLJN组(通络救脑注射液组)和DNP组(阳性药组),观察各组大鼠在药物干预7天、14天和21天后的Morris水迷宫行为学改变,阿尔茨海默病脑组织特征性病理改变(ELISA (?)去检测脑组织A β1-42含量、Western Blot法检测P-tau表达,HE染色观察神经元损伤程度)。第二部分：Western Blot法和ELISA法分别观察拟AD损伤大鼠在7天、14天和21天脑组织内皮细胞特异性损伤因子vWF和神经元特异性损伤因子NSE的蛋白表达以及血液中上述蛋白含量的变化。第三部分：通过体外培养拟AD损伤大鼠脑微血管内皮细胞,运用Western Blot和Real-time PCR实验技术分别从蛋白水平和mRNA水平考察拟AD损伤的大鼠脑微血管内皮细胞在不同时段中特定β淀粉样蛋白转运体LRP-1和RAGE表达变化、分光光度法检测氧化应激反应的变化(MDA含量、SOD活性、Cat活性、GSH-Px活性)、MTT法检测内皮细胞的损伤程度以及TLJN液的干预作用。第四部分：通过培养拟AD损伤大鼠脑微血管内皮细胞,运用Western Blot实验技术检测A β1-42通过LRP-1转运体介导的脑微血管内皮细胞内PI3K/Akt/Caspase-3信号转导通路中主要信号分子的蛋白表达变化(LRP-1、T-tau、 P-tau、Caspase-3)以及TLJN对该信号转导通路的调节作用。4.结果①在本次动物实验观察范围内,通过morris水迷宫实验,我们发现造模后散发型AD大鼠行为学发生显著改变。体现在其逃避潜伏期延长、游泳总路程距离增加、目标象限停留时间缩短以及穿台次数减少。此外,AD大鼠形态学亦发生显著变化,表现在海马神经元出现不同程度的细胞皱缩、核固缩、核溶解以及核碎裂等现象；整个脑组织Tau蛋白过度磷酸化；脑组织中A β1-42含量显著增加。在通络就脑注射液干预后,AD大鼠行为学、脑部组织结构和功能均得到了不同程度的改善。②在本实验中,AD大鼠脑组织和血液中的vWF蛋白量与假手术组比较在检测的三个时程中均显著升高,而AD大鼠脑组织和血液中的NSE蛋白量从检测的14天时间点开始才明显升高。在TLJN干预后,与模型组比较,vWF和NSE蛋白量在14天后明显降低,显示出对脑组织的改善作用。③在本次细胞实验观察范围内,LRP-1和RAGE蛋白转运体在拟AD损伤的内皮细胞中,呈现动态改变,表现在0h、3h、6h和12h四个时间点LRP-1蛋白表达升高,在24h、36h、48h和72h四个时间点蛋白表达降；而其mRNA表达在0h、3h、6h三个时间点增加,在后续时间点降低。RAGE蛋白和mRNA表达在全部8个时间点逐渐增加；在拟AD损伤的内皮细胞中,LRP-1/RAGE蛋白比值在0h、3h、6h和12h四个时间点未见统计学差异,而在后续四个时间点显著下降;然而,LRP-1/RAGE的mRNA比值在检测的8个时间点未见规律性改变。经TLJN干预后,RAGE蛋白和mRNA表达在全部8个时间点均有不同程度地降低；而对LRP-1的干预作用,仅体现在其对LRP-1蛋白表达的下调作用,未见对mRNA的调节作用;LRP-1/RAGE蛋白比值在0h、3h、6h和12h四个时间点未见组间及组内比较的统计学差异,而在后续四个时间点其蛋白比值与A β1-42损伤组比较明显升高；在拟AD损伤的内皮细胞中,细胞内氧化应激反应(MDA含量)在8个时间点逐渐增加,抗氧化酶系统(SOD、Cat、GSH-Px活性)活性在全程逐渐下降,经TLJN干预后,细胞内氧化应激反应减弱,抗氧化酶系统活性增加。④在细胞实验中,A β1-42诱导拟AD损伤内皮细胞中LRP-1受体蛋白表达下降,P-tau蛋白表达下降,Caspase-3蛋白表达升高,诱导细胞凋亡；在TLJN干预A β1-42诱导的内皮细胞后,LRP-1受体蛋白表达增加,P-tau蛋白表达增加,Caspase-3蛋白表达降低,减缓细胞凋亡；在TLJN药物和阻滞剂LY200942共同作用于A β1-42诱导的内皮细胞后,LRP-1受体蛋白表达增加,P-tau蛋白表达降低,而Caspase-3蛋白表达与Aβ1-42损伤的内皮细胞比较,明显升高,减缓细胞凋亡。5.结论①以通络救脑注射液为代表的解毒通络方药能够减轻拟AD损伤大鼠认知功能障碍,改善大鼠脑部组织AD病变的特征性病理损伤。②拟AD损伤的大鼠动物模型和脑微血管内皮细胞模型中,脑微血管病变先于神经元的损伤,由于脑微血管内皮细胞上LRP-1和RAGE两个p淀粉样蛋白转运体的动态平衡被打破,引起A β脑外转运减少,脑内聚集增加,通过LRP-1转运体介导的PI3K/Akt/Caspase-3信号转导通路,使Caspase-3蛋白表达增加,促进内皮细胞凋亡,加重拟AD损伤模型中神经元的损伤,最终形成了以认知功能障碍为主要表现的脑功能紊乱。③解毒通络药物-TLJN在干预拟AD损伤模型后,恢复了脑微血管内皮细胞上LRP-1和RAGE两个β淀粉样蛋白转运体的动态平衡,可能通过TLJN中药复方多靶点的作用途径抑制内皮细胞内Caspase-3蛋白表达,减少内皮细胞凋亡,通过调节脑微血管的功能,最终达到了改善受损神经元目的,在阐明脑微血管在神经退行性病变中重要作用的同时,一定程度上为阿尔茨海默病“毒损脑络”病机假说的确立提供了体外实验依据。