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稻瘟病是由真菌病原Magnaporthe oryzae引起的最严重的水稻病害,严重威胁水稻产量和品质。水稻栽培种地谷(Digu)是一份具有广谱持久稻瘟病抗性的遗传资源,在育种中被广泛应用,但其抗性机制尚未被完全解析清楚。本研究通过对地谷与感病材料丽江新团黑谷(Lijiangxintuanheigu,LTH)在接种稻瘟病菌后5h、10h、20h三个时间点的转录组数据进行比较分析,结合全基因组序列比对,鉴定了一个新的稻瘟病抗性(Resistance,R)基因Pid4,取得的主要研究结果如下:1.通过比较转录组分析,从已注释的511个NBS-LRR基因中筛选出9个在地谷中特异表达的NBS-LRR基因;通过地谷与66份非广谱抗性水稻材料的全基因组序列比对分析,获得2576个地谷特异的SNPs,从中筛出7个位于NBS-LRR类基因外显子或启动子区域的SNPs,且其中一个SNP对应的NBS-LRR基因,NBS2(LOC_Os06g17950),同时也是地谷中特异表达的NBS-LRR基因之一。2.通过对Digu和LTH中NBS2的基因序列与表达谱分析发现,Digu中NBS2(NBS2-Digu)编码完整NBS-LRR蛋白且基因表达量稳定;而LTH中NBS2(NBS2-LTH)由于缺失突变导致假基因化,且qRT-PCR分析未能检测到其表达。通过对含NBS2-Digu的重组自交系(RILs)和转基因株系进行稻瘟病抗性鉴定,发现该基因具有抗稻瘟病功能,并将其命名为Pid4。通过进一步的稻瘟病菌接种试验发现,Pid4同时介导叶瘟和穗颈瘟抗性,且该基因的稻瘟病抗谱与Pi-z、Piz-t、Piz-5以及Pi9的抗谱均不相同。3.通过对地谷中Pid4的时空表达谱分析发现,该基因在所检测的各个生长发育阶段及相应组织中均有表达,其中以孕穗期叶片和茎中的表达量最高,根部的表达量最低。此外,Pid4的表达量不受亲和或非亲和菌株的诱导。4.Pid4的外显子包含一个2148bp的编码区,一个587bp的5’UTR区和一个1508bp的3’UTR区。该基因编码的蛋白包含两个预测的coiled-coil基序组成的CC结构域,6个不规则的富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat)组成的LRR结构域,以及P-loop、Walker B、kinase 3a、GLPL、RNBS-D等保守基序组成的NBS结构域,是一个典型的CC-NBS-LRR蛋白。亚细胞定位实验结果显示,Pid4-GFP蛋白主要分布在细胞质和细胞核中。5.系统进化树分析结果显示,Pid4与Pi2、Piz-t、Pigm、Pi50以及Pi9同属于一个进化枝(Clade)。其中,Pi2、Piz-t、Pigm、Pi50、Pi9两两间的氨基酸序列一致性(Identity)均在95%以上,而Pid4与它们的氨基酸序列一致性均在52%左右。地谷中Pid4所在的基因簇包含14个NBS-LRR基因和3个转座子,除了Pid4以外,该基因簇另外13个NBS-LRR基因分别与Pigm基因簇的13个NBS-LRR基因一一对应,碱基序列一致性均大于99%;而Pigm(或Pi2、或Pi9)基因簇中与Pid4相似性最高的并非已报道的R基因,而是Pigm-R12(或Pi2-R12、或Pi9-R12),它们与Pid4的碱基序列一致性均在87%左右。以上结果说明Pid4是该基因簇新鉴定的R基因,与其它已报道的R基因不存在等位关系。6.Pid4等位基因的序列多样性分析结果显示,不同材料中Pid4等位基因的NBS结构域相对保守;而序列多态性主要集中在启动子区域和LRR结构域。比较Nipponbare、TP309、LTH三个感病材料中等位pid4的序列特征可发现,三个无功能pid4的编码序列均在起始密码子开始的第1294位碱基有1-bp的缺失,进而导致氨基酸编码提前终止,推测这是导致它们无功能的主要原因。此外,Pid4等位基因的表达量分析结果显示,各材料中Pid4等位基因的表达量高低与它们的抗性水平并无直接联系。7.针对Pid4基因的特异序列开发了InDel分子标记,并利用此标记对210份水稻资源材料进行了检测,发现仅有约10%的材料能检测出与Digu一致的带型。结合所检测材料的分类情况来看,检出Digu带型的材料主要分布在非洲地区且以热带粳稻型(tropical japonica)材料居多,而Pid4在亚洲稻区以及籼稻(indica)材料中被选择的程度均不高,该结果可为Pid4在水稻抗病育种中的应用提供参考。本研究证明了基于转录组和全基因组测序数据的综合分析策略在挖掘植物R基因方面的可行性。面对传统图位克隆耗时费力,且会受到亲本间遗传多样性不高等阻碍的情况,本研究为探索高效的R基因挖掘手段提供了参考。该策略还可用于鉴定因RNA剪切位点或转录调节域突变而导致植物抗性变化的基因。Pid4的成功克隆为进一步解析地谷抗病分子机制以及推动抗性基因的育种应用奠定了基础。