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芽胞杆菌属（Bacillus）分泌的脂肽类物质具有抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤等生物活性,甚至对一些多重耐药的致病菌也有良好的抑制效果。Plipastatin,又称Fengycin对真菌、尤其是丝状真菌具有较强的抑制活性,常被应用于植物根、叶致病菌的生物防治和采后果实（苹果、桃）的保鲜及饲料的储藏和防腐,减少因真菌毒素积累而造成的危害。由于脂肽类物质在农业、食品防腐保鲜领域的应用潜力和价值,开展脂肽合成代谢研究,挖掘抑制食源性致病菌的新型抗菌脂肽类物质具有重要的研究意义和价值。较传统的通过微生物发酵、分离纯化、物理或化学诱变方法获取新型脂肽相比,利用组合生物合成对脂肽非核糖体肽合成酶系改造修饰,生成新型脂肽类物质,可以充分发掘和开拓微生物基因资源,极大地丰富天然脂肽产物库,为天然绿色食品防腐剂的筛选拓宽来源。本论文主要通过基因工程技术将一株不产脂肽类物质的模式菌株B.subtilis pB2改造成联产脂肽类抗生素Surfactin和Plipastatin的工程菌株,采用菌体细胞微观结构观察、流式细胞仪和激光共聚焦测定细胞骨架等技术研究了 Surfactin和Plipastatin分别对食源性致病菌金黄色葡萄球菌和农产品致病真菌尖孢镰刀菌的影响。同时采用硫酯酶TE前移、亚基PPSE前移和模块及单个结构域敲除三种不同的组合生物合成策略对Plipastatin合成酶系进行修饰,获得并鉴定了一系列新的脂肽衍生物,探索了 TE硫酯酶在生物体内选择性催化水解和环化的能力,探讨了 COM结构域的选择性互作对新Plipastatin杂合酶系统装配线的影响,探索了模块和结构域的缺失对NRPS装配线的功能影响。主要研究结果分述如下:1.Surfactin和Plipastatin联产菌株B.subtilis pB2-L的构建及抑菌效果研究将一个由组成型启动子（P43）、功能基因（sfp）和多效调控基因（degQ）组成的基因表达框通过同源重组原理整合至不产脂肽类物质的模式菌株B.subtilis pB2基因组的amyE位点上,获得了一株Surfactin和Plipastatin联产的工程菌株B.subtilis pB2-L。使用液相质谱串联技术,在pB2-L菌株的脂肽粗提液中鉴定出了含有C14-21饱和脂肪酸链和C14-18不饱和脂肪酸链的Plipastatin,及其碳链长度为9～18的Surfactin和C12-16的线性Surfactin。采用扫描和透射电子显微镜、细胞骨架分析和流式细胞仪研究了脂肽Plipastatin和Surfatin分别对微生物细胞的影响。研究结果表明,来自pB2-L菌株的Plipastatins通过促使细胞形态畸形化、细胞内容物空泡化和破坏细胞骨架导致丝状真菌尖孢镰刀菌细胞生长抑制和细胞死亡,其最小抑菌浓度（MIC）为16 μg·mL-1;而Surfactins则通过破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜,造成胞内核酸泄露,导致细胞死,其最小抑菌浓度为20 μg·mL-1。基于工程菌株方便的遗传操作,本研究为探索脂肽Plipastatin合成酶的组合生物合成,催化新型脂肽衍生物合成奠定了基础。2.硫酯酶TE结构域前移修饰与新型脂肽的合成将脂肽Plipastatin合成酶系末端的硫酯酶TE结构域前移至Module 7、8和9的T结构域末端,分别采用 7ProT-C linker、8GlnT-C linker 和 9TyrT-E linker 连接,获得了相应的突变菌株LP1、LP2和LP3。高分辨LC-ESI-MS结果显示,菌株LP1、LP2和LP3均不能生产Plipastatin和其相关衍生脂肽。采用10IleT-TE linker分别连接Module 7、8和9的T结构域与硫酯酶TE,分别获得了突变菌株LP4、LP5和LP6。高分辨LC-ESI-MS/MS结果显示,突变菌株LP4能生产新型的线性脂七肽和环七肽,其结构分别为:C16-19β-OHFA-E-O-Y-T-E-V-P 和 C16-19β-OHFA-E-O-cyclo（Y-T-E-V-P）;LP5能生产新型的线性脂八肽和环八肽,其结构分别为:C16-17ββ-OHFA-E-O-Y-T-E-V-P-Q和 C1719β-OHFA-E-O-cyclo（Y-T-E-V-P-Q）;LP6 能生产新型的线性脂九肽C15-17β-OHFA-E-O-Y-T-E-V-P-Q-Y,及其线性脂八肽和环八肽。本研究发现了在新构建的杂合酶系中,硫酯酶TE结构域具有相对宽松的底物选择性,且10IleT-TE linker序列是酶系催化脂肽产物合成是必不可少的。3.酶亚基PPSE前移和COM替换修饰与新型脂肽的合成将Plipastatin合成酶系中的酶亚基PPSE前移至PPSB末端,产生的突变菌株LP7能够按照新设计的装配线（PPSA-B-E）合成新型脂肽衍生物环五肽,其结构为:C16-18β-OHFA-Glu-Orn-cyclo（Tyr-Thr-Ile）,该结果证明了蛋白通讯供体域 COMdppsB与非同源的受体域COMappsE进行相互通讯交流。将亚基PPSE前移至PPSC末端,产生的突变菌株LP8失去了合成相关脂肽衍生物的能力,该结果表明亚基PPSC末端的蛋白通讯供体域COMdppsC不能与非同源的受体域COMappsE兼容,不能相互交流互作。采用原始兼容和匹配的COMdppsC/COMappsD替换不兼容的COMdppsC/COMappsE,产生的突变菌株LP9合成了截断的脂六肽,其结构为:C16-17β-OHFA-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala/Val;采用COMdppsD/COMappsE替换,产生的突变菌株LP10合成了新型的线性七肽产物,其结构为:C17-18β-OHFA-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Ile。4.模块和结构域缺失修饰及新型脂肤的合成分别缺失Plipastatin合成酶系中的Module 6和7,导致形成的相应突变株BM6和BM7均丧失了合成Plipastatin相关脂肽的能力。分别缺失Module 7中单个A结构域和T结构域,形成的相应突变菌株BA7和BT7均能生产截断的线性六肽产物,其结构为:C16～17β-OHFA-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala/Val。缺失 Module 6 中的单个 T 结构域,形成的突变菌株BT6则不能生产Plipastatin相关脂肽;而缺失Module 6中的单个A结构域,形成的突变菌株BA6则能产生三种类型的新型Plipastatin衍生脂肤产物,分别为线性五肽（C16-17β-OHFA-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu）、线性六肽（C16-17β-OHFA-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ile）和线性八肽（C16-17β-OHFA-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Gln-Tyr-Ile）。本研究首次揭示了 Plipastatin杂合酶系在脂肽产物装配过程中呈现的模块跳跃现象,为将来脂肽合成酶改造催化脂肽多样性的形成提供了一个新的视野。