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花色是观赏植物重要的质量性状和经济指标之一。虽然自然界中的花色种类繁多,但是一些重要花卉的色系却有限,如玫瑰、康乃馨、郁金香等缺乏蓝色和紫色。因此,经过花色改良的观赏植物具有极高的观赏、经济价值,和广泛的市场前景。采用传统杂交育种和定向育种技术虽然对花色改良作出了巨大贡献,但存在多种局限,且费时费力、周期长、效率低等;而采用基因工程技术能有效进行花色的定向育种,其改良效果通过目测和少量辅助手段即可判定。关于花色结构基因查尔酮异构酶CHI(Chalcone Isomerase)基因对花色改变的直接报道很少,因此,本论文选用了CHI基因为目的基因,以纯深红色和纯白色矮牵牛(Petunia hybida Vilm.)为材料,研究了CHI基因的共抑制和反义抑制以及表达产物增加对花色改良的作用,并在花色改变植株中首次观察到花器官变异。论文研究内容与结果如下: 1.水母雪莲CHI基因的克隆及其序列分析 以水母雪莲(Saussurea medusa Maxim.)花的mRNA为模板,根据已知水母雪莲CHI基因(AF509335)序列,设计一对特异PCR引物,用RT-PCR方法扩增得到CHI基因。用TA连接法克隆到pUCm-T载体上,得到重组质粒pUCm-CHI。序列分析表明,该CHI基因全长810bp,ORF框全长699bp,编码蛋白长232个氨基酸(含一个终止子),预测分子量24913D,等电点PI为4.75。与以公布的CHI序列ORF完全一致。 2.CHI基因的正向和反向植物表达载体的构建 用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切pUCm-CHI和中间载体pTriplEx2,回收、连接目的片段与载体,构建中间载体pTripCHI,选择正向重组质粒。用KpnI和XbaI双酶切pTriCHI和表达载体质粒pBinAR,回收、连接目的片段与载体,构建成正向植物表达载体pBinCHI+。用KpnI和XbaI双酶切pTripCHI和表达载体质粒pBL19,回收、连接目的片段与载体,构建成反向植物表达载体pBLCHI-。采用冻融法把pBinCHI+和pBLCHI-分别转化农杆菌EHA105,LBA4404。 3.根癌农杆菌介导的CHI基因对矮牵牛的遗传转化 切取纯深红色矮牵牛无菌苗叶片,大小为5×5mm2,以OD600=0.2的农杆菌菌液感染西南农业大学硕士学位论文15min,暗培养34d取出,用含soom叭Cef的液体Mso培养基振荡脱菌2h,无菌水冲洗5次即用无菌滤纸吸干水分,然后接入Msl+Zoomg/L Cef的培养基上延迟筛选36d,再转入MSI+2 oom岁L Cef+50m留L Km培养基上进行筛选分化培养.将得到的长约Icm的芽切下接入1/2 Ms+l。mg/L Km中进行生根筛选,移栽能够正常生根的抗性苗并做进一步的鉴定。纯白色矮牵牛在延迟筛选培养和抗性选择培养中用MsZ代替Msl,其余条件不变。分别用EHA 105(pB‘ncH,+)和用LB^4404(pBLcH,一)转化纯深红色矮牵牛,其所得转化株系命名为RcH,+和R““,一。用EHA 105(pBinc川+)转化的纯白色矮牵牛,所得转化株系命名为wC“卜。未转化的纯深红色矮牵牛对照用R“表示;未转化的纯白色矮牵牛(对照)用w。表示。统计结果,RcH卜获得28株存活的抗性苗;RCHI一获得株存活的18株抗性苗:wCHI十获得存活的抗性苗15株.4.转化植株的2 x MPCR鉴定和转基因植株花色素昔含量的测定 为避免内源CHI基因的干扰,分别以CaMV35S启动子和NPTll基因为目的片段进行普通PCR检测。对普通PCR检测两种结果均为阳性的转化株系,又同时以355和NPTll为目的片段进行2 x MPcR检测,结果得到TG一RCH卜n二l一20(表示检测结果为阳性的转基因矮牵牛RcH卜有加个株系)、Te一RCH,一n=z一10和To一wcH,+n=l一10。 对2“MPCR检测结果阳性,且花色发生明显变化的TG-RcH卜,TG-R“H1一和TG一wcHI+各选取其不同花发育时期的花为材料,用R”和w”为对照,提取花中的花色素昔,用比色法测量其相对含量.结果表明,To一RcH,+和TG一R CH,一的花色素昔含量比Ro低一些;To一R CH,一的花色素昔含量比TG一RCH卜略低一些;TG一wcH卜花色素昔含量比w“略高一些。5.转CHI基因矮牵牛花色的改变与花器官变异分析 对TG一RcH卜、TG一RCHI一和TG一wcH卜株系的花发育各个时期花色进行全面观察记录,特别对花发育的V期及其以后2d内盛开的花,观察性状主要是各期花色变化、花瓣上颜色表达分布、花瓣上的网状纹路等情况。结果发现,TG一RcH卜和TG一RcH,一的花瓣颜色均比R0淡,都出现浅粉红颜色并带深色网状纹路,有的还带有不同表达模式的白色斑块;TG一R cHI一株系还具有一种新的花色模式,即花瓣上具有类似于叶部彩斑中的扫迹斑的深色纹路.TG·wC川十株系的花瓣颜色均比w0略深一些,花冠边缘具有浅粉红色的纹路,或是花冠中部具有浅粉红色的斑块,并且其颜色变化随温度升高而变浅。 对TG一RcH卜、TG一R“川一和TG一wCHI十株系的花发育各个时期花器官变化进行全面观察记录,观察性状主要是花芽形状、曹片数、花冠管粗细、花冠大小、花冠裂片、雌蕊与雄蕊数等情况。观察中发现TG一RcH卜中出现了4个变异花器官,在TG一RcH卜中出现了8类变异花器官,而在TG一wcH卜中则未观察到变异花器官。 观察到一种具有独特花器官表型和全新花?