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苛求芽孢杆菌(ATCC29604)胞内尿酸酶用于动力学方法测定血清尿酸有显著优势,还有治疗高尿酸血症的药用潜力。本实验室初步表征了天然苛求芽孢杆菌尿酸酶并获得大部分编码区的序列,但其N端序列未确认;Edman降解得N端为A(Q)E(Q)RTMFYGKGDV,而5’-RACE未获得N端两个残基编码碱基。本文首先考察所克隆序列是否为预期的尿酸酶,再构建系列N端变异体并考察它们的性质,探索有利于提高此重组表达尿酸酶比活性和稳定性的对应N端序列。1.苛求芽孢杆菌尿酸酶重组表达载体的构建据苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶主要编码区序列设计引物,从基因组PCR克隆主要编码区,再将所得序列插入表达载体pET28a中;这些表达载体在大肠杆菌中经过37℃培养、在18℃用1.0 mmol/L的IPTG诱导约20 h后,其表达量可达细菌可溶蛋白50%,在TB培养基中酶产量可达1 kU/L。去除N端甲硫氨酸后为AERTMFYGK的重组表达尿酸酶经DEAE-cellulose 52层析及制备性凝胶电泳纯化,纯度可达95%,比活性(11.5±0.5)U/mg,与天然胞内尿酸酶最大比活性接近;MALDI-TOF-MS分析发现其只有35,779 KDa的主峰,与理论计算分子量仅差约10 Da,表明此重组体尿酸酶N端甲硫氨酸已被除去。与N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶相比,此苛求芽孢杆菌天然胞内尿酸酶分子量多204 Da;如其N端第一个氨基酸为Q,其分子量仍然差147 Da。因此,此苛求芽孢杆菌天然胞内尿酸酶可能有其它修饰。2. N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶性质N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶最适温度25-30℃,最适pH为8.9-9.5;25℃、pH 9.2时Km为0.29±0.03 mmol/L (n = 5),黄嘌呤抑制常数为33±4μmol/L (n = 3)。此酶活性可被低浓度常见阳离子激活;在0.1M Tris-HCl pH 8.9的缓冲液中,镁离子的激活作用最强,可达在无阳离子时的3倍。该重组尿酸酶在pH7.4时10℃、25℃、40℃的Km分别为91±5μmol/L (n = 3)、228±15μmol/L (n = 3)、892±40μmol/L (n = 3);在pH9.2时10℃、25℃、40℃的Km分别为180±6μmol/L (n = 4)、290±30μmol/L (n = 5)、1010±50μmol/L (n = 3)。据单底物米氏动力学由初速度换算得到最大反应速度,据Arrenius经验公式计算该酶在pH7.4和pH9.2时活化能分别为31 kJ/mol和16 kJ/mol,远低于乙酰胆碱酯酶的活化能,但此酶的催化能力显然远低于乙酰胆碱酯酶。故Arrenius经验公式不适用于本文所述情况。3.苛求芽孢杆菌尿酸酶N端序列和活性的关系N端为AERTMFYGK的尿酸酶经SDS-PAGE电泳只有一35KDa的多肽;在非变性PAGE电泳中出现四聚体和二聚体两种成分,且随着该酶四聚体条带逐渐减少,酶比活性降低,与四聚体为活性形式的假定一致。C端His-tag对比活性影响很小,而N端氨基酸残基却对该酶的比活性的影响显著:N端为AERTMFYGK时最高比活性为11.5U/mg。N端为GFYGK其产物纯化后的活性仅有0.1 U/mg。非变性PAGE电泳可见N端为GFYGK时几乎仅有二聚体。对5个重组尿酸酶比较发现N端序列对其Ki、Km及最适温度和最适pH影响较小;在C端的His-tag轻微降低比活性,但能使该酶被金属离子激活更明显和pH效应更明显,并能提高40℃时稳定性。但C端的His-tag不能用Ni+亲和层析纯化,可能是该C端的His-tag未能充分显露。4.同源建模和序列功能关系的初步分析用来自杆菌尿酸酶的结构1J2G.pdb为模板(序列一致性在50%以上,相似性在70%以上),对N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶建模。发现N端序列中RTMFY中的R直接与另一个相邻亚基的C端310位附件连续ED残基靠近,预期有很强的静电相互作用,这可能是此酶透析解聚、阳离子激活等效应的结构基础;并且,这种相互作用可能影响亚基解聚和组装的精细过程。综上所述,N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶和天然尿酸酶性质相似,其N端序列脱掉了甲硫氨酸;天然尿酸酶完整序列仍不能确认,还有存在其它的修饰的可能性;其N端第三个氨基酸—精氨酸对活性中心形成可能有重要作用,后续可通过对N端序列改造来提高酶的比活性;还可在C端加入His-tag来增加酶的温度稳定性。