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2,4,6-三硝基甲苯(TNT)通常呈现为无色或淡黄色晶体状态,是一种硝基苯类爆炸物,同时也是一种重要的化工原料,在国防工业、矿山开采、基础建设等领域均有重要作用。在炸药生产区,使用企业区,以及许多战场遗址、军事训练区,TNT污染一直是主要的环境问题之一。TNT能够渗入到土壤和水系统当中,长期参与生态循环,甚至产生“粉红水”,其清理十分困难和昂贵。已有报道表明TNT对微生物、绿藻类植物、鱼、和动物均有毒害作用,同时TNT及其降解物可以被引进食物链中进而对人类健康造成严重的不良影响。短期内接触大量TNT后,会引起急性中毒,严重者可引起呼吸衰竭而死亡。人长时间的与2,4,6-三硝基甲苯进行接触,会在潜移默化中发生慢性中毒。TNT损害的靶器官主要是肝脏、晶状体、神经系统及周身血液,同时造成免疫功能降低,器官受损的人罹患贫血和癌症的几率也会大大增加。由于TNT具有明显的毒害作用,目前基于TNT的物理和化学性质,研究者已经开发了许多TNT的检测手段,如高效液相色谱(HPLC,High performance liquid chromatography),紫外,气相色谱-质谱(GC-MS,Gas chromatograph-Mass spectrometer-computer) ,激光表面增强拉曼光谱(SERS,Surface-enhanced Raman scattering) ,核磁共振,离子迁移谱等方法,然而它们都需要昂贵和复杂的仪器或繁复的样品制备方法。生物传感器以组成生命体的基础元件细胞,甚至进一步的编码核酸,以及具有特异活性的蛋白质等为检测元件,将这些元件与目标物进行充分接触,响应元件检测是否能够产生特定的识别特征,收集产生的特异性应答结果,进行识别与编码成直观的结果,从而实现得到我们期待的实验结果,这是现代工程技术领域的一个研究热点。例如使用固定化酶生物分析仪能够在抗生素工业中实现对葡萄糖等化合物的在线监测和控制,在酶制剂工业中实现糖化酶快速分析,这些都提示我们可以着眼于TNT的生物活性来开发新的检测方法。目前,基于目标物生物活性的生物传感器技术已被广泛研究以用于一些特殊的化合物、化学基团以及一些可造成环境污染的有毒化合物的检测。常用的感应元件是参与了细胞应答的启动子区域,而在众多可选择的响应元件(通常为报告基因)中,化学发光(如luxCDABE of Photorhabdusluminescens)[12]和荧光蛋白(如 green fluorescent protein,GFP)[’3]是最为普遍的两种。当前,有大量针对重金属毒害化合物的生物传感元件的报道,例如,DNA酶(脱氧核糖酶)由于对重金属离子如Pb (Ⅱ)、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)具有高的特异性和灵敏性而被应用于重金属离子传感器。将DNA酶与Pb(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)口Cu(Ⅱ)络合的功能化的DNA酶生物传感器使用荧光基团和淬光基团标记,可以使最小的检出值降低到10 nM。Liao等以钙粘蛋白为调控基因,与绿色荧光蛋白(GFP)结合,成功构建大肠杆菌DH5 α细胞生物传感器,将构建的细胞传感器用于土地和沉积物中有毒有害化合物的检测,可检测到0.1 nmol/L的锑(Ⅲ)、铬(Ⅱ)和10 nmol/L的铅(Ⅱ),因其具有极高的性价比和灵敏度因而它在实际样品中具有良好应用前景。在这些报道中也不乏关于TNT检测的报道。2004年,Eun-Mi Ho报道了在菌株Stenotrophomonas sp. OK-5中利用TNT的应激蛋白表达(TNT-induced stress shockproteins SSPs)来达到检测TNT污染物这一新方法。2012年,F. Behzadian等尝试在大肠杆菌菌株中构建甲苯及相关化合物的生物传感器系统[20]。2014年, Sharon Yagur-Kroll在大肠杆菌中发现了可感应TNT及其衍生物的启动子yqjF和ybiJ,并利用其构建了,可检测TNT的生物传感器。与此同时,我们也注意到日本的TANADA利用TNT可引起的细菌应急损伤反应的机理,将细菌应激损伤系统的关键基因作为TNT检测的感应元件,利用应激损伤SOS系统中的umu Test实现了对土壤中TNT含量的测定。已有的这些报道证实利用细菌应激损伤系统可以检测到TNT的存在,同时已证实TNT可激活大肠杆菌体内部分生理途径,这些都提示我们利用合成生物学理念筛选、改造生物学元件,并以此构建生物传感器是完全可行的。在本篇文章中,我们首先对大肠杆菌中可能对TNT产生应答反应的SOS家族启动子进行TNT应答考察,从中筛选出应答较为灵敏的启动元件,确定它们序列的相同区域和保守区域,对其启动子可变区进行随机突变,构建SOS随机启动子文库,我们命名为Mutsos启动子文库,后简称随机突变Msos文库。我们还用随机酶切方法切碎大肠杆菌K-12 MG1655基因组,构建了一个基因组启动子文库。通过文库筛选得到了一批可响应靶标分子TNT及其衍生物的全新的启动子元件,以绿色荧光蛋白GFP作为特异应答观察目标,针对这些启动元件对TNT的响应能力、灵敏度和特异性等方面为指标进行了考量,验证了这些新的感应元件的可行性。