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第一部分tRNA/ncRNA前体药生物合成与纯化及治疗骨肉瘤的疗效与机制研究目的:探索大规模高纯度基于tRNA为支架的重组RNA分子生物合成方法,为功能性非编码RNA(ncRNA)的基础研究与临床应用提供经济而可靠的材料来源。在系列生物工程化tRNA/ncRNA分子中筛选出有效的新型前体药,评价tRNA/ncRNA前体药在异种移植肿瘤小鼠模型中对原位骨肉瘤的治疗效果及其效应机制。方法:通过克隆系列ncRNA 分子(miR-34a、miR-124a、miR-144、miR-126、simiR-21)序列,插入 tRNA-pre-miRNA-34a(pre-miR-34a 不含成熟 miR-34a 序列)支架相应位点形成tRNA/ncRNA嵌合体,构建表达质粒,转染大肠杆菌HST08菌株,采用阴离子交换快速蛋白质液相色谱(FPLC)方法分离与纯化在HST08中表达的目标tRNA/ncRNA分子,以变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(urea PAGE)估计目标tRNA/ncRNA分子的含量和纯度;进一步通过高效液相色谱法(HPLC)定量分析tRNA/ncRNA分子纯度,采用CleanAll DNA/RNA Clean-up试剂盒去除tRNA/ncRNA纯化物的内毒素并采用Pyrogent-5000动态内毒素比浊法检测tRNA/ncRNA纯化物中内毒素含量,Nanodrop 2000分光光度计测定纯化tRNA/ncRNA分子的浓度并计算其产量。人骨肉瘤143B细胞转染pCCLc-Luc-EGFP慢病毒载体,构建luciferase荧光素酶和eGFP荧光蛋白阳性表达细胞系用于后续试验;系列生物工程合成tRNA/ncRNA分子转染143B细胞、MG-63细胞,72小时后采用Celltiter-Glo发光细胞活力检测法测定药物的抗骨肉瘤增殖活性;随后选择具有极佳抗骨肉瘤细胞增殖效应的tRNA/ncRNA(tRNA/miR-34a)以梯度浓度处理143B细胞,以同样方法检测细胞活力,评价药物剂量-反应关系,计算药效学参数,包括ED50、Hill slope、底值(Bottom);采用qRT-PCR和western blotting分别分析tRNA/miR-34a前体药处理的143B细胞内miR-34a水平及其靶标蛋白c-MET、SIRT1的表达;143B细胞胫骨骨膜下注射构建原位骨肉瘤SCID鼠模型,尾静脉注射tRNA/miR-34a前体药治疗,通过小动物生物发光活体成像系统检测的肿瘤信号强度和游标卡尺测量的肿瘤大小监测肿瘤生长情况;所有试验均设置药物载体及tRNA/MSA作为对照。采用GraphPad Prism进行统计分析,p<0.05时差异具有统计学意义。结果:系列生物工程化 tRNA/ncRNA(tRNA/miR-34a、tRNA/miR-124a、tRNA/miR-144、tRNA/miR-126、tRNA/simiR-21)分子可在大肠杆菌HST08菌株中累积至相当高水平。FPLC法能快速分离目标ncRNA分子;培养物经纯化后可获得大约占提取总RNA分子20～30%的tRNA/ncRNA分子。Urea PAGE分析显示tRNA/ncRNA嵌合体具有极高的同质性和纯度;HPLC分析显示目标tRNA/ncRNA纯度高达98%以上;内毒素检测显示1μgtRNA/ncRNA纯化产物内含有内毒素<3.0EU;经Nanodrop 2000定量目标RNA分子显示从1L细菌培养物可获得约10～20mg tRNA/ncRNA嵌合体。系列tRNA/ncRNA分子抗骨肉瘤细胞增殖活性检测显示,与药物载体、tRNA/MSA相比,tRNA/ncRNA前体药均可显著抑制骨肉瘤143B细胞、MG-63细胞增殖,其中tRNA/miR-34a前体药对143B细胞生长的抑制率可达50%以下。tRNA/miR-34a前体药抑制骨肉瘤143B细胞生长呈剂量依赖性,且比tRNA/MSA抑制效果更显著,其中tRNA/miR-34a前体药对143B细胞的抑制可达100%,而tRNA/MSA最大抑制率仅达34%。tRNA/miR-34a前体药处理的143B细胞内成熟miR-34a水平比tRNA/MSA或药物载体处理组高约200倍,并且能显著减少143细胞内miR-34a靶蛋白c-MET、SIRT1的水平。无论从肿瘤信号强度和范围还是测量的肿瘤大小上,tRNA/miR-34a前体药治疗可显著抑制SCID鼠原位骨肉瘤的生长。结论:基于tRNA作为支架的重组RNA生物工程合成方法可经济而有效地大规模生产高纯度而均一的生物活性tRNA/ncRNA分子。生物工程合成的tRNA/miRNA-34a嵌合体作为前体药在细胞内以miRNA-34a的形式有效控制骨肉瘤生长。生物工程化RNA分子具有进一步发展为新型大分子治疗药物的价值。第二部分阿霉素、tRNA/miR-34a前体药与索拉非尼联合治疗骨肉瘤及肺转移的疗效及机制研究目的:采用多种高度临床相关的动物模型以更真实而全面地评价新型抗肿瘤药物及治疗方案的可行性及有效性。基于多因素参与骨肉瘤增殖-侵袭-转移过程,采用"饱和攻击"策略,合理联合应用阿霉素、miRNA-34a前体药(tRNA/miR-34a)、索拉非尼共靶向骨肉瘤内DNA、RNA、蛋白激酶,探索药物间的联合效应及其机制,在原位骨肉瘤自发性肺转移和广泛肺转移晚期骨肉瘤小鼠模型中评价联合用药方案对于控制骨肉瘤进展、改善高转移性骨肉瘤预后的有效性和安全性。方法:采用免疫荧光和western blotting分别分析阿霉素、tRNA/miR-34a前体药、索拉非尼单独或联合处理的143B细胞内相应药物效应靶点或标志物γH2A.X、c-MET、p-Erk1/2的表达水平;将梯度浓度的阿霉素、tRNA/miR-34a前体药、索拉非尼单独或联合处理143B细胞,72小时后采用Celltiter-Glo发光法检测骨肉瘤细胞活力,评价药物剂量-反应关系,计算药效学参数,包括ED50、Hillslope;采用Chou-Talalay方法计算联合指数(CI),评价药物之间相互作用;采用8.0mm PET膜且包被基质胶的Transwell小室检测药物处理后143B细胞的侵袭性。143B细胞胫骨内注射构建原位骨肉瘤自发肺转移SCID鼠模型,阿霉素、tRNA/miR-34a前体药、索拉非尼单独或联合治疗,监测SCID鼠的体重,通过小动物生物发光活体成像系统检测的肿瘤信号强度和游标卡尺测量的肿瘤大小反映肿瘤生长情况;收集血液样本行血液生化学分析;解剖分离原位肿瘤和肺组织,原位肿瘤称重比较,肺组织切片H&E染色行组织学检查,计量肺内骨肉瘤转移灶数目及转移灶长径之和。143B细胞尾静脉注射构建广泛肺转移晚期骨肉瘤SCI]D鼠模型,阿霉素+索拉非尼、tRNA/miR-34a前体药单独或联合治疗,记录SCID鼠的死亡率及死亡时间进行生存分析;SCID鼠死亡后尸检肺组织验证广泛肺转移的存在。采用GraphPad Prism进行统计分析,p<0.05时差异具有统计学意义。结果:γH2A.X免疫荧光分析显示,阿霉素导致143B细胞γH2A.X荧光信号强度显著增高,而索拉非尼和tRNA/miR-34a前体药单独或联合均可增强阿霉素诱导的yH2A.X水平升高效应。Western blotting检测显示,与药物载体相比,tRNA/miR-34a前体药减少了 40%的c-MET蛋白表达,而阿霉素或索拉非尼均可明显上调c-MET,tRNA/miR-34a可阻断阿霉素和索拉非尼诱导c-MET增加的作用;对p-Erk1/2而言,较药物载体,索拉非尼抑制了 80%Erk1/2的磷酸化,阿霉素或tRNA/miR-34a可下调约20%p-Erk1/2水平,三药联合时p-Erk1/2下调水平与索拉非尼单独应用时相当。阿霉素、索拉非尼和tRNA/miR-34a单独抑制143B细胞增殖呈剂量依赖性;二联或三联用药抑制效果要强于单独给药;药物联合效应分析显示,低浓度索拉非尼和tRNA/miR-34a联合时,两者抗细胞增殖效应为相加甚至拮抗作用;而阿霉素与索拉非尼或tRNA/miR-34a或索拉非尼+tRNA/miR-34a的联合在抑制143B细胞的增殖中呈协同效应,其中三联药物组在所有浓度及抗增殖效应下均产生协同作用,且在联合用药时阿霉素和tRNA/miR-34a可实现明显的剂量减低。细胞侵袭性检测显示,tRNA/miR-34a可抑制143B细胞的侵袭达50%,阿霉素联合索拉非尼减少细胞侵袭力达74%,而三药联合应用则抑制其侵袭性超过90%。原位骨肉瘤自发肺转移SCID鼠模型中,无论从生物发光信号强度与范围还是原位骨肉瘤的体积与重量上,阿霉素、索拉非尼、tRNA/miR-34a前体药三联治疗对原位骨肉瘤生长的抑制程度均高于药物载体、二联或单独给药;而肺转移的发生无论是从GFP信号的分布范围还是信号强度上,三联药物治疗显示出对肺转移最大程度的抑制。肺组织切片可见,三联药物疗法一致地显示最小的肺转移范围(15.0-287.5mm,平均116.3mm)和最少的肺转移灶数目(2-4个,平均3.0个),明显少于药物载体治疗(475.0-1212.5mm,平均829.9mm;9-29个,平均18.75个)。在药物治疗结束后,所有SCID鼠显示出5-10%的体重损失,ALT、AST、总胆红素、BUN和肌酐水平均有变化,但在正常范围内,且cTnI水平均在0.156ng/ml以下;药物载体组中1只SCID鼠在最后一周出现了严重的体重减轻和异常BUN和肌酐水平。在广泛肺转移晚期骨肉瘤SCID鼠模型中,生存分析显示,阿霉素+索拉非尼或单独tRNA/miR-34a前体药治疗将SCID鼠的中位生存时间从38天延长至54天,而三药联合治疗将SCID鼠中位生存时间延长至60.5天。在接种后第56天所有载体治疗组的SCID鼠均死亡,而三药联合治疗组仍有50%存活;在研究结束时,三药联合治疗组仍有25%的SCID鼠存活。结论:在原位骨肉瘤SCID鼠模型中,阿霉素、tRNA/miR-34a前体药、索拉非尼联合治疗骨肉瘤、抑制肺转移十分有效而安全。阿霉素、tRNA/miR-34a前体药、索拉非尼联合治疗可延长晚期骨肉瘤的生存时间而改善其预后。共靶向细胞内DNA、RNA和蛋白质分子的新策略为开发治疗致死性肿瘤转移提供了新方向。