论文部分内容阅读
目的：探讨脂多糖（LPS）诱导大鼠肝细胞CBS-H2S、CSE-H2S体系的规律性变化；查明CBS、CSE分别及联合来源的H2S在LPS诱导肝细胞凋亡中的作用，探讨内源性H2S调节作用相关信号转导机制。 方法：大鼠肝细胞系BRL细胞培养，用CBS siRNA、CSE siRNA或CBS、CSE选择性抑制剂 AOAA、PAG单独或联合应用于正常培养的 BRL细胞、LPS处理的BRL细胞。用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法检测CBS、CSE的基因和蛋白表达变化、蛋白定位，用去蛋白法检测细胞内源性H2S生成量变化；生化方法检测细胞上清LDH活性、细胞MDA含量、细胞GSH含量以及MTT细胞生长抑制率变化；用流式细胞术、Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率变化；荧光显微镜检测线粒体膜电位（MMP）变化；Western blot检测细胞色素C（Cyt C）、caspase-3激活体蛋白表达变化。分别用CBS、CSE选择性抑制剂AOAA、PAG和PKCε、P44/42、STAT3特异性抑制剂（SCP0213、A6355、S31-201）交互作用的方法处理 LPS诱导BRL细胞凋亡，提取细胞不同组分蛋白质如细胞总蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白、核蛋白，用Western blot检测LPS诱导BRL细胞凋亡过程中信号分子PKCε、P44/42、STAT3磷酸化修饰、PKCε活化后膜移位、STAT3活化后核移位。 结果：1、大鼠肝细胞系BRL细胞在静息条件下存在着CBS和CSE基因、蛋白表达以及内源性H2S生成，CBS、CSE蛋白阳性表达定位于细胞浆；CBS siRNA、CSE siRNA分别引起BRL细胞CBS、CSE蛋白表达下调，内源性H2S生成明显减少，细胞凋亡率明显增高，其中，相对于CBS siRNA引起BRL细胞H2S生成减少，CSE siRNA引起BRL细胞H2S生成减少更明显，CBS siRNA、CSE siRNA联合应用可进一步引起内源性H2S降低；与Negative control组比较，CBS siRNA、CSE siRNA单独或联合转染 BRL细胞4-24h，BRL细胞出现凋亡，而且凋亡率随时间变化而明显增加（P﹤0.05）。其中，CBS siRNA转染后，BRL细胞在4h、8h、12h、24h细胞凋亡率分别为12.80％、24.23%、27.67%和31.73%；CSE siRNA转让后，BRL细胞凋亡率在4-24h分别为17.27%、26.30%、32.33%和37.00%；当联合转染CBS siRNA与CSE siRNA后，BRL细胞凋亡率在4-24h分别为21.06%、30.40%、36.20%和42.40%。CBS siRNA、CSE siRNA分别或联合作用对BRL细胞上清LDH活性、细胞MDA含量、细胞GSH含量及MTT细胞增殖活力均无明显影响。2、CBS、CSE选择性抑制剂AOAA、PAG单独或联合作用BRL细胞，内源性H2S生成减少，细胞凋亡率上升， MMP明显降低，胞浆Cyt C、caspase-3激活体蛋白表达上调，其中，PAG引起内源性 H2S生成比 AOAA作用时生成量更少，细胞凋亡率明显上升，MMP下降，胞浆Cyt C、caspase-3激活体蛋白表达上调；AOAA、PAG可引起BRL细胞上清LDH活性增高，而细胞MDA含量、细胞GSH含量及MTT细胞生长抑制率无明显影响。3、LPS作用BRL细胞，随LPS作用时间延长（0~24h）及LPS作用浓度（0.1~100μg/ml）升高，CBS和CSE基因、蛋白表达明显上调，内源性H2S生成呈时间依赖性和剂量依赖性明显增多；细胞凋亡率上升，细胞MMP降低，胞浆Cyt C、caspase-3激活体蛋白表达上调；BRL细胞上清LDH活性增加，细胞MDA含量上升，细胞GSH含量在8h上调，12h、24h下降，MTT细胞生长抑制率在8h下调，12h、24h上升。4、CBS siRNA、CSE siRNA或AOAA、PAG单独或联合与LPS共同作用BRL细胞，与LPS单独作用组相比，BRL细胞凋亡率在4h上升，8h无显著性差异，12h、24h明显下降；细胞MMP在4h下降，8h无显著性差异，12h、24h明显上升；胞浆Cyt C、caspase-3激活体蛋白表达在4h上升，8h无显著性差异，12h、24h明显下降。5、LPS作用BRL细胞，信号分子PKCε、P44/42、STAT3磷酸化蛋白表达上调，30min显著高于溶剂处理；其中，PKCε发生膜转位，STAT3发生核转位；AOAA、PAG单独或联合与 LPS共同作用 BRL细胞，与 LPS单独作用组相比，PKCε、P44/42、STAT3磷酸化蛋白表达（进一步明显）上调；与LPS单独作用组相比，PKCε、P44/42、STAT3特异性抑制剂（SCP0213、A6355、S31-201）分别与LPS共同作用BRL细胞，细胞凋亡率在4h、12h时间点明显上升；与CBS、CSE选择性抑制剂AOAA、PAG+LPS作用组相比，PKCε、P44/42、STAT3抑制剂（SCP0213、A6355、S31-201）与CBS、CSE选择性抑制剂AOAA、PAG和LPS共同作用BRL细胞，4h时间点细胞凋亡率未见明显变化，12h时间点细胞凋亡率明显上升；与LPS单独作用组相比，PKCε抑制剂（SCP0213）作用BRL细胞，P44/42、STAT3磷酸化蛋白表达下调；与LPS单独作用组相比，P44/42抑制剂（A6355）作用BRL细胞，PKCε磷酸化蛋白表达未见明显变化，STAT3磷酸化蛋白表达下调；与LPS作用组相比，STAT3抑制剂（S31-201）作用BRL细胞，PKCε、P44/42磷酸化蛋白表达均未见明显变化。 结论：1、大鼠肝细胞系BRL细胞在静息条件下存在着CBS和CSE基因、蛋白表达以及内源性H2S生成，其中CBS来源的H2S略少于CSE来源H2S；抑制内源性H2S生成可引起正常培养的BRL细胞凋亡；内源性H2S对LPS诱导肝细胞凋亡具有调节作用，少量生成增多H2S抑制细胞凋亡、多量生成的H2S促进细胞凋亡；2、细胞凋亡的线粒体途径参与介导了内源性 H2S对肝细胞凋亡的调节效应；信号分子PKCε、ERK1/2、STAT3参与介导内源性H2S对LPS引起肝细胞凋亡的调节作用，内源性H2S调控肝细胞凋亡的信号转导通路可能为PKCε—ERK1/2(P44/42)—STAT3。3、查明 LPS诱导肝细胞 CBS-H2S、CSE-H2S体系的规律性变化，初步揭示肝细胞CBS-H2S、CSE-H2S体系之间可能存在着的相互调节作用。