中药药性理论是中药作用性质及特征的集中概况。”药对”是依据药性以及七情和合理论的两味中药固定配伍形式。黄连与吴茱萸药对属寒热配伍代表性药对。基于“寒者热之,热者寒之”中医理论,黄连吴茱萸药对配伍变化后寒、热药性发生变化,其治疗的证候也有所不同。研究发现,黄连吴茱萸药对不同配伍对寒热模型都有治疗效果,但在具体生化指标上无法体现黄连吴茱萸药对配伍变化后药性的差异。代谢组学作为一种基于全局观点的整体性研究方法,与中医治疗疾病的整体观、辨证观相一致。因此,为了阐明黄连吴茱萸药对配伍引起的药性变化,揭示黄连吴茱萸药对配伍“寒者热之,热者寒之”的科学内涵,本文以大鼠胃热证和胃寒证模型表征黄连、吴茱萸药对不同配伍的寒热药性变化,采用代谢组学研究方法从整体上揭示黄连吴茱萸药对配伍药性变化的科学内涵。主要研究内容如下:一、胃热证、胃寒证大鼠模型代谢组学研究1.基于GC-MS的血浆代谢组学研究胃热证、胃寒证大鼠整体代谢变化本文通过主成分分析方法(PCA)发现正常组、胃热证组和胃寒证组大鼠明显聚为3类,说明三种不同生理状态下的动物模型在内源性代谢产物表达上有显著差异。以偏最小二乘判别分析(PLS-DA)筛选出与大鼠胃热证相关的36个潜在生物标记物,与大鼠胃寒证相关的16个潜在生物标记物。研究发现与胃热证相关的生物标记物和与胃寒证相关的生物标记物虽有重叠,但是大多数不同,即使影响的生物标记物一样,调节方向也不尽相同,因此这些内源性代谢物可以作为区分胃热证和胃寒证的标志性成分。本文采用代谢通路智能分析方法寻找与胃热证以及胃寒证相关的代谢通路。研究结果表明胃热证主要影响丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成、磷酸肌醇代谢、酪氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢和合成类固醇等代谢通路。胃寒证主要影响丙氨酸,天冬氨酸,谷氨酸代谢和甘油磷脂代谢等代谢通路。2.基于UPLC-QTOF-MS的血浆代谢组学研究胃热证大鼠整体代谢变化本文通过PCA图发现正常组、胃热证组明显聚为2类,说明二种不同生理状态下动物模型在内源性代谢产物表达上有显著差异。其中共筛选出10个与胃热证相关的潜在生物标记物。采用代谢通路智能分析方法寻找与胃热证相关的代谢通路。研究结果表明胃热证主要影响甘油磷脂代谢。3.基于数据融合的胃热证大鼠模型代谢通路分析采用Multi-block PCA算法融合基于UPLC-QTOF-MS和GC-MS的胃热证大鼠血浆代谢组学数据,通过PCA图发现正常组、胃热证组明显聚为2类,说明二种不同生理状态下的动物模型在内源性代谢产物表达上有显著差异。各区块的载荷图共筛选出47个与胃热证相关的潜在生物标记物,其生物标记物与GC-MS、LC-MS代谢组学筛选的生物标记物有重合。本文采用代谢通路智能分析寻找与胃热证相关的代谢通路。研究结果表明胃热证主要影响苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、磷酸肌醇代谢、酪氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢和合成类固醇、柠檬酸循环等代谢通路。该结果与GC-MS、LC-MS胃热证代谢组学代谢通路研究有重合。但通过Multi-block PCA算法融合发现胃热证还影响苯丙氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、柠檬酸循环等代谢通路。柠檬酸循环中涉及的一些代谢中间体已经证明是炎症信号。该研究说明数据融合能发掘更多的信息,更合理解释胃热证所致疾病相关机理。二、黄连吴茱萸药对的药性变化机理研究1.基于GC-MS代谢组学的黄连吴茱萸药对对胃热模型的影响研究从PCA得分图中发现左金丸和反左金丸都能不同程度上改善胃热证,左金丸更靠近正常组、反左金丸更靠近模型组。左金丸影响与胃热证相关的5个代谢通路,L-酪氨酸、肌醇-1-磷酸、丙酮酸、L-苯丙氨酸、胆固醇和菜油甾醇等内源性代谢物被显著回调到正常水平。反左金丸调节3个与胃热证密切相关的代谢通路,L-酪氨酸、胆固醇、菜油甾醇等内源性代谢物显著改变。说明对胃热证的治疗,左金丸药性符合中医“热者寒之”理论。肌醇-1-磷酸、丙酮酸、L-苯丙氨酸、酪氨酸等内源性代谢物可以作为区别左金丸和反左金丸治疗胃热证的生物标记物。研究发现黄连和吴茱萸都能不同程度上改善胃热证,由PCA得分图可见,黄连组更靠近正常组、吴茱萸组更靠近正常组。提示对胃热证的治疗,左金丸中黄连起主要作用,黄连药性符合中医“热者寒之”理论。针对胃热证模型,本文比较小檗碱干预前后代谢谱的的变化。从PCA图中发现,小檗碱与黄连组距离较近并有部分重合,说明小檗碱和黄连在治疗胃热证上的作用接近。揭示小檗碱可能是黄连治疗胃热证的主要有效成分,同时也提示小檗碱具有“热性”的性质。2.基于UPLC-QTOF-MS代谢组学的黄连吴茱萸药对对胃热模型的影响研究本文发现左金丸、反左金丸、黄连和吴茱萸都能不同程度上改善胃热症,从PCA得分图中发现左金丸组更靠近正常组、反左金丸组更靠近模型组,黄连组更靠近正常组、吴茱萸组更靠近模型组。左金丸、反左金丸、黄连、吴茱萸通过降低磷脂类代谢物,纠正甘油磷脂代谢通路紊乱,PC(19:0)、LysoPC(16:0)、LysoPE(20:0)、PS(18:1)、肾上腺素等内源性代谢物可以作为区别左金丸和反左金丸治疗胃热证的生物标记物。本文研究小檗碱干预前后胃热证代谢谱的的变化,从其PCA图中发现小檗碱和黄连治疗胃热证的作用比较相近,揭示小檗碱可能是黄连治疗胃热证的主要有效成分,同时也提示小檗碱具有“热性”的性质。3.基于GC-MS代谢组学的黄连吴茱萸药对对胃寒模型的影响研究本文发现对于胃寒证的治疗中,对1H-吲哚-2,3-二酮、谷氨酰胺、甘油-3-磷酸和核糖酸等内源性代谢物,反左金丸接近正常组,左金丸接近模型组。这说明对胃寒症的治疗,反左金丸符合中医“寒者热之”理论。此外,研究发现左金丸组与反左金丸组相比较,容易产生偏性,如左金丸和反左金丸对苯甲酸的调节都产生偏向模型的趋势,但是左金丸组的偏向性更强。除此之外在对葡萄糖、十七酸,乳酸,甲基磷酸酯的调解中也存在这种趋势。与正常组相比,模型组中代谢物4-羟基丁酸、2-氨基丁酸、癸酸和十四烷酸的含量偏低,左金丸和反左金丸都能使代谢物的含量升高,但是左金丸与正常组有显著性差异,提示对“寒者寒之”可能会加重病情的发展。1H-吲哚-2,3-二酮、谷氨酰胺、甘油-3-磷酸和核糖酸等内源性代谢物可以作为区别左金丸和反左金丸治疗胃寒证的生物标记物。本文发现对于胃寒证的治疗中,对4-羟基丁酸、棕榈油酸等内源性代谢物,吴茱萸组接近正常组,黄连组接近模型组。提示对胃寒症的治疗,吴茱萸药性符合中医“寒者热之”理论,黄连吴茱萸药对中吴茱萸起主要作用。此外本文发现黄连与吴茱萸相比较,容易产生偏性。如黄连和吴茱萸对D-半乳糖-1,4-内酯的调节都产生偏向模型的趋势,但是黄连的偏向性更强。除此之外在对D型半乳糖-1,4-内酯、十七酸,葡萄糖,乳酸的调解中也存在这种趋势。与正常组相比,模型组中代谢物代谢物癸酸和十四烷酸的含量偏低,黄连和吴茱萸都能使代谢物的含量升高,但是黄连与正常组有显著性差异,提示黄连可能会加重胃寒证病症的发展。三、黄连吴茱萸药对化学成分与内源性代谢物关联性研究通过OPLS关联化学成分和左金丸、反左金丸、吴茱萸、黄连各给药组内源性代谢物含量发现黄连吴茱萸药对中八个化合物小檗碱、巴马汀、黄连碱、药根碱、表小檗碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、羟基吴茱萸碱主要关联34个内源性代谢物变化。其中发现有22个内源性代谢物含量变化有以下规律:黄连组与左金丸组没有显著性差异;反左金丸组和吴茱萸组没有显著性差异,;左金丸与正常组没有显著性差异,反左金丸组和模型组没有显著性差异,左金丸与反左金丸组之间存在显著性差异,提示通过化学成分关联的内源性代谢物完全可以表征左金丸和反左金丸药性差异的实质,说明对胃热证的治疗,左金丸药性符合中医“热者寒之”理论。本文将筛选到的生物标记物经过代谢通路智能分析发现左金丸、反左金丸、黄连、吴茱萸主要会对有苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成;D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢;β-丙氨酸代谢;苯丙氨酸代谢;精氨酸和脯氨酸代谢;丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢;磷酸肌醇代谢;丙酮酸代谢;酪氨酸代谢;糖酵解或糖异生;谷胱甘肽新陈代谢和柠檬酸循环(TCA循环)代谢通路产生不同影响。该结果与基于GC-MS代谢组学的黄连吴茱萸药对对胃热模型的影响研究结果互相验证。通过多变量回归分析表明黄连吴茱萸药对化学成分变化与丙酮酸等内源性代谢物存在线性关系,说明内源性代谢物变化主要是黄连吴茱萸药对化学成分变化引起的。四、乙醇致胃溃疡模型作为胃热证模型使用的探索性研究及应用1.乙醇致胃溃疡模型作为胃热证模型使用的探索性研究本文发现对大鼠急性胃黏膜损伤的保护,左金丸有优于反左金丸的趋势,该结果与左金丸和反左金丸对胃热证模型的治疗效果类似。说明乙醇致胃溃疡模型可以作为胃热证模型使用。左金丸和反左金丸对相关的炎症因子调节方向一致,这与左金丸和反左金丸胃热证的治疗机理研究现状也是一致。研究发现黄连对大鼠急性胃黏膜损伤明显的保护作用,吴茱萸效果不明显。2.比较黄连中主要生物碱对乙醇致胃溃疡模型的治疗作用本文发现硫酸小檗碱对大鼠胃黏膜的保护作用要强于盐酸小檗碱,提示小檗碱的成盐方式和溶解度对胃热证的治疗效果影响比较大。此外,黄连中巴马汀、药根碱、黄连碱对大鼠胃黏膜都有不同程度的保护作用,但硫酸小檗碱和巴马汀效果最好,揭示小檗碱和巴马汀可能是黄连治疗胃热证的主要有效成分。在相关机理研究中发现,黄连生物碱主要通过抗氧化和抗炎治疗胃热证。3.比较小檗碱及苦瓜叶皂苷成分配伍对对乙醇致胃溃疡模型的治疗作用为从天然资源中开发抗胃溃疡药物,本文以组分配伍的模式将苦瓜叶皂苷与小檗碱配伍,比较小檗碱、苦瓜叶皂苷、苦瓜叶皂苷与小檗碱配伍对乙醇诱发的大鼠急性胃黏膜损伤的保护作用。发现苦瓜叶皂苷与小檗碱配伍后,其对大鼠胃粘膜的保护作用强于小檗碱和苦瓜叶皂苷。