第一部分LncRNA-MIAT基因启动子序列变异位点与心肌梗死关联性研究研究背景:心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是影响人类健康的一类主要疾病。据统计,我国每年因CVD死亡的人数约有350万,平均每10秒就有1人因CVD而死亡,占居民总死亡人数41%。尽管已知的吸烟、高血脂、高血压、糖尿病(diabetes mellitus,DM)、肥胖等传统危险因素与CVD发病有关。现发现CVD与遗传易感性也存在密切的相关性,因而目前有大量的研究试图从遗传学角度去解释CVD的病因。长链非编码RNA(long no-coding RNA,lncRNA)作为一种重要的遗传物质,发现其在生命活动调节中扮演着重要的角色。有大量研究发现lncRNA参与CVD的发生,但分子机制不明。心肌梗死相关转录本(myocardial infraction association transcript,MIAT)作为 lncRNA 的一种,全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)发现其与CVD存在相关性,尤其与急性心肌梗死(acute myocardial infraction,AMI)密切相关。LncRNA-MIAT可通过内源性竞争miRNA调节基因的表达,可促进细胞增殖、炎症蛋白的生成和抑制细胞自噬等,参与疾病的发生发展。基因的表达直接受启动子的控制,因而我们推测lncRNA-MIAT基因启动子与AMI的发生、发展以及预后等相关。基于目前lncRNA与AMI的相关性研究,本研究从MIAT基因启动子入手,探讨MIAT基因启动子序列变异(DNA sequence variants,DSVs)与AMI的相关性。研究目的:通过病例对照研究的方法,分别对病例组和对照组人群lncRNA-MIAT基因启动子序列测序,发现并分析MIAT启动子DSVs与AMI的关联性。研究方法:1、分别各纳入220例在济宁医学院附属医院住院的AMI患者和同期健康体检者,抽取5ml空腹外周血,提取对应的基因组DNA。2、从 NCBI 数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中下载人lncRNA-MIAT基因启动子序列,将序列分为两段重叠片段,分别设计PCR引物。3、PCR扩增lncRNA-MIAT基因启动子序列,琼脂糖凝胶电泳验证大小后送上海生工生物有限公司测序,比对并寻找DSVs。4、运用SPSS 20.0进行统计分析,计量资料采用t检验,计数资料采用χ2检验,采用logistics回归分析MIAT基因DSVs与AMI的相关性。研究结果:由于测序不完整或测序峰图基线不稳等因素,最终符合标准的样本AMI有218例,对照组212例。对最终纳入研究的两组人群的基线资料统计分析发现,两组人群在甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、体重指数(body mass index,BMI)上无差异,在性别、年龄、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)等方面差异有统计学意义。该研究人群总共发现16个DSVs,包括10个单核苷酸多态位点(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)。其中有 2 个 DSVs 只出现在病例组中,分别为g.3997C>T,g.4917G>C;仅在对照组中出现的DSVs有5个,分别为 g.4270C>T,g.4360G>T(rs1055293700),g.4665C>T,g.4874G>A,g.5159G>T;在两组中均出现的DSVs有9个,且均为SNPs,分别为g.4004C>T(rs56371714),g.4063T>C(rs5752375),g.4112C>T(rs55892869),g.4137T>C(rs9608515),g.4359insG(rs151057042),g.4445A>T(rs2157598),g.4453insA(rs150465374),g.4675C>T(rs5761664),g.4933T>C(rs8142890)。由于rs1055293700只在对照组中出现1例,因而对其他的9个SNPs进行统计学分析。对两组中SNPs基因频率进行χ2检验,仅发现rs5752375和rs 9608515两个位点差异有统计学意义(P值分别为0.02、0.04)。运用Logistic回归分析,结果显示:rs5752375和rs 9608515与AMI之间存在明显的相关性,差异有统计学意义,而其他位点 rs56371714,rs55892869,rs151057042,rs2157598,rs150465374,rs5761664,rs8142890差异无统计学意义。对于rs5752375位点,较CC基因型,TT 基因型使 AMI 发病风险增加了 3.91 倍[OR=3.91,95CI(1.27,12.02),p=0.02];而对于rs9608515位点,TT基因型较CC基因型AMI的发病风险增加了 3.11倍[OR=3.11,95CI(1.10,8.74),p=0.03]。调整性别、年龄、吸烟、高血压和 DM、LDL与HDL 比等危险因素后,再次分析rs5752375和rs9608515多态性与AMI的相关性,差异仍具有统计学意义。对于rs5752375位点,较CC基因型,TT基因型是 AMI 发病的重要危险因素[OR=7.11,95%CI(1.64,30.79),P=0.01];对于rs9608515位点,TT基因型也是AMI发病的重要危险因素[OR=5.56,95%CI(1.43,21.64),P=0.01]。研究结论:年龄、血脂异常是AMI发病的传统危险因素。在lncRNA-MIAT基因启动子中新发现了 2个与AMI相关的DSVs,另发现2个多态位点rs5752375和rs9608515与AMI存在明显的关联性,且TT基因型是AMI发病的危险因素,而其他位点 rs56371714,rs55892869,rs151057042,rs2157598,rs150465374,rs5761664,rs8142890与AMI未发现明显的统计学相关性,这一结果对AMI早期诊断具有重要意义。第二部分LncRNA-MIAT基因启动子序列变异位点功能研究研究背景:急性心肌梗死(acute myocardial infraction,AMI)是冠状动脉粥样硬化性心脏病中最严重的类型,早期诊断与早期治疗对其预后有重要意义。目前对于AMI的诊断主要依据患者症状、心电图表现、心肌酶学相关指标,但心电图、心肌酶学的变化往往出现在症状发生之后,不能达到早期诊断。对于AMI的治疗多采用介入治疗的手段,但患者间存在个体差异,部分患者尽管行支架植入,但患者预后依旧较差。随着精准医疗的提出,对于AMI的精准诊断和精准治疗也成为目前研究的新方向。精准医学试图通过分子生物学的方法早期诊断、早期预防、早期治疗,为个体化医疗服务提供依据。第一部分实验在AMI患者中新发现了 lncRNA-MIAT 相关序列变异位点(DNA sequence variants,DSVs),因此本部分实验对新发现的DSVs进行功能性分析,旨在为AMI诊断和治疗提供相关精准医疗证据。研究目的:通过构建双酶荧光素报告基因载体,转染细胞后测其生物学活性,对已新发现的DSVs进行功能分析,了解DSVs在启动子序列中的功能。研究方法:1、从NCBI下载人MIAT基因启动子序列,设计PCR引物序列,并在两端加上合适的酶切位点,将设计的引物序列交由上海生工生物有限公司合成;2、对DSVs相关MIAT基因启动子序列全长PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳验证大小并对PCR扩增产物进行胶回收纯化;3、将片段大小合适的胶回收产物分别于T-Vector(pMDTM19)使用连接酶连接,构建MIAT基因启动子TA克隆载体;4、对构建的克隆载体转化DH5α感受态细胞并在LB固体培养皿中培养,挑选单个菌落进行菌落PCR,将片段大小合适的单克隆菌落培养后送至上海生工生物有限公司测序,筛选符合条件的克隆子;5、对符合条件的克隆子抽提质粒,并将得到的克隆载体和PGL3空质粒使用合适的限制性内切酶双酶切,对酶切产物行琼脂糖凝胶电泳验证大小并进行胶回收纯化;6、将胶回收后的MIAT启动子目的片段分别与酶切后的PGL3使用连接酶连接,构建PGL3表达载体;7、同方法4筛选符合条件的克隆子;8、分别将构建的PGL3报告载体与内参pRL-TK共转染HEK293和H9c2细胞,检测报告基因酶活性。研究结果:本研究成功构建了 lncRNA-MIAT启动子野生型(Wild type,WT)和含有序列变异位点的PGL3荧光报告载体,分别为PGL3-WT、PGL34917C、PGL3-3997A、PGL34874A。报告基因酶活性结果表明,在病例组中发现的DSVs能够改变lncRNA-MIAT启动子转录活性,并且DSVs存在细胞特异性。在HEK-293细胞中仅有g.4917G>C降低了 lncRNA-MIAT启动子转录活性,在H9c2细胞中g.3997C>T和g.4917G>C均降低了 lncRNA-MIAT启动子转录活性。研究结论:AMI病人中lncRNA-MIAT启动子DSVs可影响MIAT基因的表达。第三部分LncRNA-MIAT基因启动子序列变异位点与心肌梗死机制研究研究背景:基于前部分的研究,我们发现lncRNA-MIAT基因启动子序列变异(DNA sequence variants,DSVs)可以改变启动子转录活性,因而本部分利用生物信息学和凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)进一步探究DSVs与MIAT基因表达相关的具体机制,揭示相关DSVs在急性心肌梗死(acute myocardial infraction,AMI)发生中的分子机制。研究目的:对在AMI中新发现的DSVs进行机制研究,为AMI的发病机制提供实验依据。研究方法:1、使用 JASPAR program(http://jaspar.genereg.net/)在线网站分析lncRNA-MIAT启动子DSVs是否改变转录因子结合;2、根据DSVs在序列中所在位置,设计合适的生物素标记探针并由上海生工生物有限公司合成;3、分别抽提两组不同来源细胞(HEK-293细胞,H9c2细胞)的细胞核蛋白;4、将标记好的生物素探针分别于细胞核蛋白进行结合反应,将反应混合物进行EMSA,由于不同大小的蛋白在凝胶中的迁移速率不同,将进行完EMSA实验的凝胶转膜,根据生物素发光的原理观察生物素标记探针与核蛋白结合的结果。研究结果:JASPAR program网站在线分析发现,在AMI中新发现的DSVs可能会改变相关转录因子结合,主要表现在新增部分转录因子、消除部分转录因子或改变转录因子与启动子的结合能力等。DSV g.3997C>T可能消除E2F1、KLF5、SP1、SP8、TBX15、ZNF740、ZBTB7C等转录因子与启动子结合的位点,增加FOXD2、EGR2、EGR3、NFIC、NFIX、SP3等转录因子与启动子序列的结合,改变KLF9、KLF4、KLF16、EGR1、MGA等转录因子与启动子的结合能力。DSVg.4917G>C 可能消除 KLF16、TFDP1、MZF1、SP3、PAX5、SP8、THAP1、TBX4、TBX5、TBX15、MGA等转录因子与启动子结合的位点,增加ELK1、E2F4、ELK4、ETV5、ELF1、TEAD1、RORC、TFAP2C、TFAP2B、ZBTB7A等转录因子与启动子序列的结合,改变E2F6、E2F1、E2F4、EGR1、CTCFL、KLF5、SP1、SP2、TFAP2A、ZNF263等转录因子与启动子的结合能力。EMSA结果显示,在AMI中新发现的LncRNA-MIAT基因启动子DSVs可以改变转录因子的结合,其中g.3997G>C对转录因子结合的影响比较明显。研究结论:AMI病人中发现的lncRNA-MIAT基因启动子DSVs可能改变转录因子的结合,影响lncRNA-MIAT基因的表达。