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脑水肿是缺血再灌注后出现的主要临床症状,大量研究显示孕酮对脑有显著保护作用,能减轻脑创伤及中风动物模型脑损伤后的脑水肿,促进脑组织和功能的修复。最近有研究发现AQP4参与了孕酮对动物模型的创伤性脑水肿的保护作用。孕酮对定位于星形胶质细胞上的AQP4表达及功能的调控及机制国内外未见报道。目的：通过研究孕酮对缺血再灌注损伤的星形胶质细胞水肿形成的影响,探讨AQP4在孕酮调控星形胶质细胞水肿过程中的作用。内容：1.星形胶质细胞的原代培养,胶质酸性纤维蛋白(GFAP)免疫组化染色鉴定。2.建立氧糖剥夺(OGD)细胞模型,并研究OGD对星形胶质细胞的影响作用,选择适宜OGD时间(4h)进行再灌注(R)。3.观察不同再灌注时间对星形胶质细胞肿胀及AQP4的影响,选择最佳再灌注时间点(24h)进行研究。4.孕酮对OGD/R损伤星形胶质细胞的水肿及AQP4的影响,孕酮受体(PR)及蛋白激酶C (PKC)在此过程中的作用研究。方法：1.从新生大鼠皮质取材,通过细胞培养、差速粘附和震荡分离并纯化星形胶质细胞进行原代培养。2.免疫组化、HE染色对原代培养的星形胶质细胞进行纯度鉴定及形态学观察。3.采用三气培养箱,建立星形胶质细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型。4.MTT法、LDH漏出率检测OGD持续的不同时间对星形胶质细胞的损伤影响。5. Western blotting检测再灌注持续的不同时间对OGD4h细胞模型的AQP4蛋白表达影响。6.MTT法、LDH漏出率测量及Western blotting检测不同剂量孕酮对OGD4h/R24h细胞模型的细胞活性和AQP4蛋白表达影响作用。7. Western blotting、免疫荧光染色观察阻断PR及PKC后,1μM孕酮对OGD4h/R24h损伤细胞AQP4、PKC蛋白表达影响。结果：一、OGD对星形胶质细胞的影响作用。1.OGD2h未能对细胞形态和活性产生明显影响(P>0.05),随OGD时间增加,细胞活力逐渐下降,OGD4hMTT值显著下降(P<0.05)。和正常对照组(OGD0h)的细胞比较,OGD4h、6h和8h细胞的MTT值显著较低(P<0.05)。OGD4h后MTT值下降56.4%。2.LDH漏出随OGD时间延长呈增加趋势。二、氧糖剥夺4小时再灌注(OGD4h/R)对星形胶质细胞的影响作用。1. Western blotting检测显示,与正常对照组(Control)比较,OGD4小时AQP4表达显著下降(P<0.05),再灌注4小时后AQP4表达上升至正常水平,随着再灌注时间的延长,AQP4表达逐渐上升。再灌注12小时,AQP4表达显著高于正常对照组(P<0.05)。一直持续至再灌注48小时后AQP4表达依然很高(P<0.05,Fig.2-3)。2.OGD4h细胞形态无明显变化,随着再灌注时间的延长,细胞胞体隆起、发亮,再灌注24小时,细胞普遍肿胀、透亮,一直持续至再灌注48小时。三、不同剂量孕酮对氧糖剥夺4小时再灌注24小时(OGD4h/R24h)的星形胶质细胞影响作用。1.与正常对照组(Control)比较,OGD4h/R24h各实验组细胞活力均显著下降(P<0.05), LDH释放显著增加(P<0.05)；与溶剂对照组(Vehicle)比较,正常对照组、OGD4h/R24h+Pg(1-2μM)组细胞活力显著较高(P<0.05), LDH释放显著减少(P<0.05)。提示1μM、2μM孕酮能显著缓解OGD/R对细胞造成的损伤。2. Western blotting检测显示,与正常对照组比较,OGD4h/R24h各实验组AQP4表达均显著升高(P<0.05)；与溶剂对照组比较,正常对照组、OGD4h/R24h+Pg(1,2μM)组的AQP4表达显著较低(P<0.05),提示1μM、2μM孕酮能显著降低OGD4h/R24h所致的AQP4蛋白表达的升高。四、孕酮(1μM)对OGD4/R24细胞作用的信号转导机制实验。1.LDH的漏出检测显示,与正常对照组比较,OGD4h/R24h各实验组细胞LDH释放均显著增加(P<0.05)；与溶剂对照组比较,Pg+Ro31-8220组细胞LDH释放无显著差异性(P>0.05),正常对照组、Pg组和Pg+RU-486组细胞LDH释放显著减少(P<0.05)。提示Ro31-8220抑制孕酮对OGD/R损伤细胞的保护作用,而RU-486并未影响孕酮的保护作用。2. Western blotting检测显示,与正常对照组比较,OGD4h/R24h各实验组细胞的AQP4蛋白表达均较正常对照组细胞明显增高(P<0.05)。与溶剂对照组比较,正常对照组、Pg组和Pg+RU-486组AQP4蛋白表达显著降低(P<0.05),Pg+Ro31-8220组AQP4蛋白表达无显著差异性(P>0.05)。提示Ro31-8220抑制孕酮对OGD/R所致的AQP4蛋白表达的下调作用,而RU-486对此并无影响。3. Western blotting检测显示,与正常对照组比较,PKC蛋白表达在各实验组间无显著差异性(P>0.05)。4.形态学观察发现,Pg组和Pg+RU-486组星形胶质细胞肿胀程度明显较轻,大多数细胞形态正常,夹杂有部分细胞胞体发亮,突起明显。溶剂对照组和Pg+Ro31-8220组细胞胞体普遍出现肿胀,突起明显,细胞核不明显。5.免疫荧光双标染色观察显示,绿色荧光(AQP4)在溶剂对照组和Pg+Ro31-8220组较强；红色荧光(PKC)在各组间强弱区别不明显。同一视野下AQP4绿色荧光与PKC红色荧光融合后,并未出现明显黄色荧光(绿色与红色荧光重显色为黄色荧光)。结论：星形胶质细胞在OGD4小时后,细胞活性下降约50%,细胞形态未发生明显改变,AQP4蛋白表达显著下降。再灌注24小时后,细胞损伤程度增大(MTT值下降,LDH释放增多),细胞胞体肿胀,同时AQP4蛋白表达显著增加,高于正常对照组细胞。孕酮对于OGD4/R24损伤的星形胶质细胞有显著保护作用(提高细胞活性,减少LDH释放),能缓解缺血再灌注造成的细胞水肿,同时伴有AQP4蛋白表达的显著下降。进一步研究发现,孕酮的此种作用可以被PKC阻滞剂抑制,而孕酮细胞核受体阻滞剂却并未影响孕酮对AQP4表达下调作用,但孕酮并没有改变各组间PKC蛋白的表达。本课题证实孕酮通过抑制AQP4的表达来减缓OGD4/R24对星形胶质细胞造成的水肿伤害,而PKC的激活介导了孕酮对AQP4的抑制作用,并且这种作用不依赖于孕酮的核受体。