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微孢子虫(microsporidia)作为一类专性细胞内寄生的单细胞真核病原微生物,被称为自然界最“成功”的寄生者。在漫长的进化进程中,形成了丰富的物种多样性。自1857年,Carl Nageli首次分离出家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)以来,人类踏上了微孢子虫研究的漫长征程。迄今为止,已报道的微孢子虫超过187个属,1,500余种,甚至有报道称,微孢子虫种的数量有可能与动物种的数量相当。微孢子虫的宿主范围非常广泛,可感染从无脊椎动物(特别是昆虫)到脊椎动物(包括人)的几乎所有动物类群。研究者们对微孢子虫的诸多宿主进行了调查研究,水蚤、线虫、昆虫(包括蝗虫、蜜蜂、家蚕)、鱼类、兔类以及人都确认了可被微孢子虫感染。目前感染这些宿主的主要微孢子虫已完成了基因组测序分析,使人们对微孢子虫生物学有了新的认知。可以推测,自然界中仍然存在大量的、未鉴定的微孢子虫种,对微孢子虫的物种多样性,有待进行更深入的研究。金凤蝶作为一种鳞翅目昆虫,因其体态华贵,具有较高的观赏价值,同时也是一种重要的药用资源昆虫。2012年我们从金凤蝶体内分离到的一株微孢子虫,其与家蚕微孢子虫的超微结构和基因组序列都极其相似。对该病原进行鉴定及基因组研究,不仅对防控金凤蝶微孢子虫病有重要的意义,也对研究家蚕微孢子虫的起源及进化具有重要的科学价值。本研究从该病原微孢子虫的生物鉴定入手,在全基因组测序数据的基础上,对其进行了蛋白质编码基因的预测与注释,并对其与家蚕微孢子虫的基因组做了比较基因组学分析,研究了其基因家族、基因重复、基因组结构及转座子信息。主要研究结果如下：1、寄生于金凤蝶的微孢子虫的分离及分类学鉴定从金凤蝶体内分离到一株病原微孢子虫,通过对其形态与超微结构进行观察,并对16S rDNA序列进行分析,发现其与家蚕微孢子虫有很近的亲缘关系。该微孢子虫的成熟孢子大小为3.22±0.46 μm×1.96±0.30μm,具有双核结构,极管为10～13圈,在宿主细胞内无寄生泡。rRNA基因全长4,286 bp (GenBank收录号为KM190863),与家蚕微孢子的rDNA序列相似度高达97.64%。感染分析发现,该微孢子虫能够感染家蚕。基于rDNA序列的系统发生分析表明,该微孢子虫属于Nosema属,且与家蚕微孢子虫、灰翅夜蛾微孢子虫以及小菜蛾上分离到的微孢子虫Nosema sp. PX1构成的进化枝互为姐妹枝,命名为Nosema sp. PM-1。2、Nosema sp. PM-1基因组测序及注释分析对Nosema sp. PM-1基因组序列中的高度重复序列进行预测屏蔽,利用Glimmer软件,结合家蚕微孢子虫的蛋白质序列,从188条骨架序列(Scaffold)中注释出2,605个蛋白质编码基因,平均长度为795 bp,编码序列全长占整个基因组(7.7 Mb)的26.9%。对Nosema sp. PM-1与家蚕微孢子虫的蛋白质编码基因进行比较分析,结果显示,Nosema sp. PM-1的编码基因数目约为家蚕微孢子虫的一半,基因长度的分布与家蚕微孢子虫类似。在Nr、SwissProt、KEGG、GO等数据库中搜索这2,605个编码基因的同源序列,获得了其中2,264个基因的功能注释信息。其中具有GO分类信息的基因有963个,具有来自Nr库功能注释的基因有1,344个。通过SMART功能结构数据库分析,有2,182个Nosema sp. PM-1的基因包含功能结构域。其中385个基因具有跨膜域,这可能与其寄生生活相关。3、Nosema sp. PM-1基因家族分析基于MCL算法,分别对Nosema sp. PM-1和家蚕微孢子虫的基因进行聚类,预测了两种微孢子虫的基因家族。在Nosema sp. PM-1基因组中共得到291个多基因家族,包含944个编码基因,占其基因总数(2,605)的36.2%。家蚕微孢子虫具有1,077个多基因家族,包含了3。,639个编码基因,占其基因总数(5,128)的71.0%。Nosema sp. PM-1多基因家族的数量和比例都远小于家蚕微孢子虫,这在一定程度上解释了两种微孢子虫基因组大小差异的来源。不同微孢子虫需要适应的宿主不同,受到的选择压力大小也各不相同,相应地可能经历了不同的基因重复事件。相对于Nosema sp. PM-1,家蚕微孢子虫可能发生过大规模的基因重复。利用OrthoMCL聚类程序,对Nosema sp. PM-1 和家蚕微孢子虫总共的7,733个蛋白质编码基因进行聚类分析,获得了1,756个直系同源基因簇。包含来自于Nosema sp. PM-1的1,878个编码基因与来自家蚕微孢子虫的2,,482个编码基因。Nosema sp. PM-1的直系同源基因占其基因总数(2,605)的72.1%,家蚕微孢子虫的直系同源基因占其基因总数(5,128)的48.6%。这些数据再次证明,Nosema sp.PM-1与家蚕微孢子虫有很近的亲缘关系。两种微孢子虫共有的同源基因主要参与催化(catalytic)、结合(binding)、细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)等基础途径。利用基因家族及序列同源性,在Nosema sp. PM-1中鉴定到了极管蛋白、孢壁蛋白、Ricin B-凝集素蛋白以及丝氨酸蛋白酶抑制物等重要的功能基因。基于Nosema sp. PM-1和家蚕微孢子虫的基因注释以及序列同源性,在Nosema sp. PM-1的2,605个编码基因中鉴定到了103个家蚕微孢子虫不具有的基因。相应地,在家蚕微孢子虫的5,128个基因中鉴定到了423个Nosema sp. PM-1不具有的基因。4、Nosema sp. PM-1基因组重复分析基因组重复是基因组研究的重要内容,在Nosema sp. PM-1基因组中存在片段重复、串联重复以及散在重复。与家蚕微孢子虫基因组中的三类重复信息比较发现,两种微孢子虫在重复序列的数目和类型比例上都存在差异。Nosema sp. PM-1具有250个片段重复,占基因组总长的10.9%,包含278个片段重复基因；有106个串联重复,占全基因组的7.4%,包含238个串联重复基因；其它534个散在重复基因占全基因组的1.5%。而家蚕微孢子虫具有993个重复片段,占全基因组总长的21.5%；有86个串联重复包含186个基因,占基因组的2.7%；其它1333个散在重复基因占基因组的3.2%。以上数据表明,相对家蚕微孢子虫,Nosema sp.PM-1更偏向于串联重复,而家蚕微孢子虫的基因重复则多以片段重复的形式出现。5、Nosema sp. PM-1与家蚕微孢子虫基因组共线性分析基于两种微孢子虫直系同源基因在各自基因组上的位置信息,鉴定获得了Nosema sp. PM-1与家蚕微孢子虫的443对共线性区域。Nosema sp. PM-1基因组中53%(4.1 Mb)的区域与家蚕微孢子虫基因组中27%(4.2 Mb)的区域具有共线性关系。这443对共线性区域中,基因序列相似度多在95%以上,而基因间区序列相似度明显偏低。表明两种微孢子虫共线性区域内基因序列高度保守,但非编码区序列存在较大差异。这些共线性区域分布于Nosema sp. PM-1的78条Scaffold以及家蚕微孢子虫的271条Scaffold上。以Nosema sp. PM-1单条Scaffold为基础建立的共线性图谱表明,Nosema sp. PM-1的一条Scaffold在家蚕微孢子虫的多条Scaffold上具有共线性关系,表明Nosema sp. PM-1与家蚕微孢子虫的基因组结构存在较大差异。Nosema sp. PM-1与家蚕微孢子虫之间最长的一段共线性区域超过100 kb,包含了Nosema sp. PM-1的48个基因,以及家蚕微孢子虫的66个基因,其中的同源基因有39对。以其中长约15 kb、不含gap的片段为例,可发现共线性区域内既有序列相似性极高的区段,又有基因的插入＼删除以及基因重复、基因反向等变异较大的区段。高相似度的长段共线性区域表明,Nosema sp. PM-1与家蚕微孢子虫有着很近的亲缘关系,其基因组序列非常相似。但共线性区段内部的具体差别又暗示着Nosema sp. PM-1与家蚕微孢子虫从最近的共同祖先分化后,有着不同的进化历程,两基因组已经有了一定的差异。6、Nosema sp. PM-1转座元件分析利用RepeatMasker程序检索RepBase数据库,在Nosema sp. PM-1基因组中鉴定了670条转座元件序列,总长为381 kb,占基因组全长的4.95%,远小于家蚕微孢子虫基因组中转座元件的含量(38.57%)。对其转座元件进行分类发现,最大的家族为Gypsy家族,该家族在Nosema sp. PM-1基因组中存在101个拷贝,总长为141 kb。其在Nosema sp. PM-1所有转座元件中所占比例为37%,远高于其在家蚕微孢子虫转座元件中的比例(9.5%),暗示着两种微孢子虫分化后,该家族的转座子在Nosema sp. PM-1基因组中发生了较大规模的扩增。借助MITE-Hunter软件,对全基因组中的MITE转座元件进行预测发现,Nosema sp. PM-1基因组中有21个MITE转座子家族,包含5个Stowaway-like类,1个Tourist-like类,2个Pegasus-like类和13个新的MITE转座子家族。与家蚕微孢子虫的MITE比较发现,NpmME20与NbME1为同一家族,且在家蚕微孢子虫基因组内拷贝数是Nosema sp. PM-1中的30倍,表明两种微孢子虫从最近的共同祖先分化后,该家族的转座子在家蚕微孢子虫中经历了爆发式的扩增。对21个NpmMEs家族在Nosema sp. PM-1基因组内的多拷贝序列及其在家蚕微孢子虫基因组中的同源拷贝,作两两遗传距离分析发现,NpmME1和NpmME8家族的遗传距离大于NpmME10、NpmME13和NpmME16家族,暗示着前两者更为古老。调查NpmMEs在其基因组中的位置发现,NpmMEs转座子偏向于插入基因侧翼非编码区。部分NpmMEs序列包含基因的启始密码子或终止密码子,改变了基因原有的结构。通过本研究,我们鉴定到了一株新的Nosema属微孢子虫,命名为Nosema sp. PM-1。对其形态和宿主特征进行了分析,为家蚕微粒子病病原的流行病学研究提供了良好的素材。分类学及比较基因组学分析确定了Nosema sp. PM-1是一株与家蚕微孢子虫近源,但又有明显不同的微孢子虫。预测获得的编码基因和转座元件等信息为进一步研究该微孢子虫的功能基因组学和微粒子属微孢子虫的基因组进化提供了数据。