论文部分内容阅读
中国是世界第一肝炎大国,且乙肝病毒感染引起的肝衰竭是我国最常见的肝脏疾病死亡原因。在西方国家,过量服用对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是导致急性肝衰竭的最主要原因。目前临床上对肝炎,尤其是肝衰竭仍缺乏有效的治疗药物,因此开展高效低毒的肝炎/肝衰竭治疗新药的研发具有重要的实用价值和社会意义。鉴于细胞死亡在几乎所有类型的肝脏疾病中具有决定性作用,目前靶向凋亡和坏死性凋亡成为治疗肝病的研究方向之一。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是人体内最重要的诱导细胞凋亡的分子之一,在多种肝炎发生发展过程中发挥重要作用。死亡受体5(Death receptor 5,DR5)是亲和力最高的TRAIL受体,天然状态下可以可溶性DR5(Soluble DR5,即sDR5)存在。sDR5能结合TRAIL,但不能传导信号,从而阻断TRAIL介导的细胞凋亡。本研究通过制备重组人sDR5和免疫球蛋白Fc片段(sDR5-Fc)融合蛋白,并对其在小鼠、大鼠和食蟹猴体内的药理、安全性、药代动力学、疗效和机制进行了研究。主要研究内容包括以下4个方面:(1)sDR5-Fc蛋白的制备和特性研究。通过基因工程技术,融合DR5细胞外结构域和人IgG1 Fc片段基因,转染CHO-K1细胞,筛选获得稳定高表达sDR5-Fc的细胞株。通过大规模细胞培养和蛋白纯化,获得药用级的sDR5-Fc蛋白,纯度超过99%,亲和力达E-10 M,能特异性结合TRAIL,有效阻断TRAIL诱导的细胞凋亡。(2)sDR5-Fc在刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)诱导肝炎模型中的药效学研究。sDR5-Fc能有效治疗Con A诱导的小鼠肝炎/肝衰竭。在机制上,sDR5-Fc在体内可以抑制肝细胞死亡,减轻炎症反应。在体外,sDR5-Fc可以抑制Con A或抗CD3抗体激活的脾细胞产生炎性细胞因子,通过下调NF-κB的活化。与这些结果一致的是,TRAIL–/–小鼠注射Con A后,或其脾细胞在Con A或抗CD3抗体激活后,产生的炎性细胞因子水平均比TRAIL+/+小鼠显著性低。(3)sDR5-Fc在APAP诱导肝炎模型中的药效学研究。sDR5-Fc能有效治疗APAP诱导的小鼠肝炎/肝衰竭。机制上,APAP诱导小鼠的肝损伤严重程度和死亡率与血清sTRAIL水平相关。APAP诱导大量CD11b+Gr1+中性粒细胞浸润肝脏,这些细胞的膜表面表达TRAIL,可以分泌sTRAIL,杀伤表达DR5的肝细胞。另外,这些细胞表达CD80、CD86和MHCⅡ分子,可以促进T细胞增殖。APAP通过上调DR5的表达,使肝细胞对TRAIL诱导的细胞死亡更敏感。因此,TRAIL-DR5信号通路在APAP诱导的肝炎/肝衰竭中起关键的作用。sDR5-Fc能减少肝脏细胞的凋亡,减轻肝脏炎症,恢复肝脏功能。sDR5-Fc能与N乙酰半胱氨酸协同治疗APAP诱导的肝炎/肝衰竭。(4)sDR5-Fc的安全性研究。单次静脉输注sDR5-Fc的最大耐受剂量在小鼠、大鼠和食蟹猴中分别超过2198、1500和1200 mg/kg。重复静脉输注13周sDR5-Fc的未观察到不良反应剂量在大鼠和食蟹猴中分别为200和100 mg/kg。sDR5-Fc药物呈线性动力学特征,在食蟹猴中平均半衰期>1.9天。sDR5-Fc重复静脉输注给予食蟹猴12周后,sDR5-Fc暴露量以近似剂量比例增加,平均蓄积因子为1.822.11倍。sDR5-Fc静脉注射给予大鼠后,主要分布在血浆,通过尿液排出。综上所述,sDR5-Fc,作为第一个药用TRAIL阻断剂,在治疗TRAIL驱动的肝炎、肝衰竭疾病中安全有效,有望发展成为新的肝炎、肝衰竭治疗药物。