研究背景乳腺癌是乳腺上皮细胞发生癌变的恶性肿瘤,是世界上严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一。现在全球乳腺癌的发病率逐年上升,近年来中国大部分的城市调查显示乳腺癌的发病率和死亡率居前二位,有逐年上升的趋势,成为人口疾病中死亡率增长最快的癌症,而且乳腺癌的发病年龄出现年轻化的趋势,随着年龄增大发病率也增加。因此防治乳腺癌具有重要的意义。乳腺癌按其浸润程度可分为原位癌、浸润性癌,以浸润性导管癌多见。目前乳腺癌发病的机制尚未完全清楚,但是肿瘤的发生、发展是一个极其复杂的过程,是癌基因和抑癌基因参与的多因素、多阶段及多步骤的过程。乳腺癌的发生、发展过程与多种肿瘤相关因子及其功能改变密切相关。肿瘤的发生是在某些复杂因素作用下,细胞在基因水平表达出现异常,复制、转录及翻译,无论哪个环节均可出现调控失常,最终使细胞产生异常增殖。当机体免疫功能絮乱,免疫因子发生异常的情况下也可导致肿瘤的发生发展。恶性肿瘤在机体内具有其复杂而又异质性的微环境,以至于只有某些特定的分子可以进入血管或者淋巴管,让肿瘤细胞能顺利逃逸机体的免疫攻击,得以优势生长甚至转移。肿瘤微环境内存在着许多因素使机体的免疫状态受到抑制,这些抑制性因素主要分为：T细胞功能障碍；肿瘤细胞表面抑制性配体,如PD-Ll.B7x:抑制性免疫调节细胞；抑制性细胞因子,如TGF-β;肿瘤弱抗原性及凋亡因子等。有研究发现乳腺癌的发生、发展过程中出现局部微环境变化,在病灶内的T淋巴细胞数量减少及免疫功能减弱。T淋巴细胞是机体免疫应答的重要细胞,是识别外源性抗原及发生有效免疫应答的关键、是抗肿瘤免疫的基础。在免疫系统中,T细胞、抗原提呈细胞(APC)以及T细胞受体(TCR)与多种协同刺激分子受体的关系是极其复杂的,协同刺激分子既可激活T细胞,也可传递负性调节信号抑制T细胞的活化。T细胞的活化以及抑制信号的相互作用在调节机体免疫系统识别内源性及外源性抗原发挥特别重要作用,从而防止自身免疫性疾病的发生发展。T淋巴细胞发挥作用主要表现为T细胞的活化与增殖,免疫应答初期,TCR识别并结合由APC上抗原肽-MHC分子复合物,接着由抗原提呈细胞上的协同刺激分子提供刺激信号,这样T细胞才能产生免疫应答反应。免疫应答过程中的双重信号是必须同时存在才能完成的,如果免疫应答过程中出现协同刺激分子减少,仅有第一信号将会导致T细胞活化受抑制或者是特异性免疫耐受,T细胞进入失去功能的无应答状态,最终导致细胞凋亡并失去抵抗肿瘤的免疫能力。根据协同刺激分子的功能各异可将其分为正性协同刺激分子和负性协同刺激分子。近年来发现B7家族的新成员程序性死亡配体-1(PD-L1)是典型的负性协同刺激分子,是目前免疫学研究领域的热门对象之一。PD-1称程序性死亡-1,是CD28/CTLA-4家族成员之一,其配体是B7家族成员PD-L1和PD-L2。 PD-1通常与其配体共同组成信号通路,并能传导抑制性信号给T细胞从而阻断正常免疫应答的发生。PD-1是由288个氨基酸组成的免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白,由胞外区、疏水性跨膜区、胞浆区共同组成。其胞外区由一个IgV样结构域、4个重要的N连接糖基化位点构成,该结构可能在与配体的结合中发挥重要的作用。胞浆区含两个酪氨酸残基,形成免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM),而免疫受体酪氨酸抑制基序可通过酪氨酸的磷酸化作用拮抗抗原受体刺激信号的功能,因此在免疫应答过程中发挥重要的负性调控作用。PD-1表达于自然杀伤细胞、树突状细胞和活化的单核细胞、活化的T细胞、B细胞上。正常状态下T、B细胞不表达PD-1,但是在激活情况下其表达上调。PD-1的两个配体PD-L1和PD-L2均属B7家族成员。PD-1/PD-L1介导的负性刺激信号途径能够抑制T细胞的功能,在免疫调节反应中起负性调节作用,并且对自身免疫、肿瘤免疫、移植免疫及慢性病毒感染等都有重要的意义。大量研究表明PD-L1在T细胞免疫反应中的调解作用具有双重性。首先,PD-L1能刺激初始的T细胞增殖、分化；另外,其可抑制活化的T细胞增殖、分化,甚至促进T细胞的凋亡,导致效应性T细胞生物功能受到显著抑制。生理状态下,组织细胞、内皮细胞、免疫细胞等表面表达PD-L1,它与活化T细胞表面PD-1结合,抑制T细胞进一步增殖、活化,使机体的免疫应答反应维持在一定水平,处于动态平衡。而PD-L1对T细胞不同的作用还会受到TCR和CD28信号的强弱的影响,在低于适量TCR信号刺激时,PD-L1对T细胞的增殖明显抑制；在没有CD28协同刺激信号时给予最适量TCR信号,此时是促进T细胞增殖的作用。有研究表明,PD-L1能与受体PD-1结合后能显著降低IL-2、IFN-γ和IL-10的分泌。而CD4+T细胞可自分泌IL-2,而大量的IL-2能与PD-1/PD-L1途径产生的抑制作用相拮抗。对于CD8+T细胞自分泌的IL-2较少但分泌大量IFN-y,因此,PD-1/PD-L1途径对CD8+T细胞的抑制作用更加明显。总之,PD-1/PD-L1抑制途径对活化的CD8+T细胞的进一步增殖和活化有显著的抑制作用,肿瘤细胞能借助此途径逃逸CTL的杀伤作用,从而减弱机体对肿瘤细胞的免疫应答.PD-1/PD-L1途径产生的抑制效应可以被CD28信号或IL-2所逆转。应用阻断型抗PD-L1单抗阻断PD-1/PD-L1信号能够通过上调IL-2 IFN-y的分泌而有效逆转CD4+T和CD8+T细胞的增殖受抑,同时明显增强T细胞的活化程度和杀伤能力。Dong等在动物实验研究中发现带有PD-L1基因的P815肿瘤细胞系在体外试验中可抵抗CTL裂解,肿瘤细胞表达的PD-L1与活化的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞上的PD-1结合,能促进该T细胞的凋亡,小鼠接种后其致瘤性和侵袭性更加强。而通过阻断PD-1/PD-L1信号相互作用则可逆转该信号通路的抑制效应,增强CTL的杀伤肿瘤细胞的功能,有效抑制肿瘤的生长。有研究证实在负荷黑色素瘤细胞的小鼠上接种阻断性抗PD-L1单抗能阻断PD-1/PD-L1途径在肿瘤免疫应答中的作用,能有效延长小鼠的生存时间。目前乳腺癌的治疗手段从原来单一的手术治疗发展为现在的包括手术治疗、化学治疗、放射治疗及生物学治疗的综合性治疗。随着分子生物学、免疫学研究的出现,不断深入探索使分子免疫学领域的知识得以在乳腺癌治疗中应用,越来越多的免疫学分子指标成为了乳腺癌研究的热点。如近年来,ER、PR、HER-2已成为乳腺癌患者免疫组织化学常规检查的标志性项目。尽管乳腺癌被认为是免疫原性不如黑色素瘤或肾细胞癌,但越来越多的证据表明乳腺癌与机体免疫应答反应相关。有研究揭示了在外周血以及乳腺癌患者的肿瘤中存在免疫调节性T细胞(Treg)。此外,有研究发现乳腺癌组织内,PD-L1和CD28分子家族的抑制性受体在肿瘤免疫特异性T细胞上的表达上调。综上所述,PD-L1参与了肿瘤的发生、发展过程,并协助肿瘤细胞逃避机体免疫系统的杀伤作用,使肿瘤可以进一步恶化。对于乳腺癌与PD-L1表达上调是否有关系,需要进一步的研究来明确。目的探讨PD-L1在乳腺癌中的表达情况,以及其与患者临床病理参数、预后的相关性。为乳腺癌的治疗以及预后提供临床参考价值。方法1.提取乳腺癌细胞株mRNA,逆转录为cDNA后,并以此为模板进行荧光定量PCR,检测乳腺癌细胞中PD-L1基因的表达；2.用Western Blot (蛋白质印迹)法检测10对乳腺癌及癌旁组织的PD-L1蛋白的表达量;3.购乳腺癌组织芯片,用免疫组化的方法检测乳腺癌组织中PD-L1的表达,分析其与患者各项临床指标及预后的关系；4.资料数据采用SPSS13.0版统计软件进行统计分析。检测乳腺癌细胞株PD-L1表达采用单向方差分析、多重比较采用LSD法检验；蛋白印迹检测PD-L1蛋白,两组间的比较采用两独立样本t检验；PD-L1阳性表达与乳腺癌临床病理特点之间的关系采用χ2检验、Fisher确切概率法。生存分析采用Kaplan-Meier方法进行分析,生存率比较用Log-rank检验。多元回归分析采用COX回归模型进行分析。P<0.05认为有统计学差异。结果1. qRT-PCR结果显示,乳腺癌细胞株中ZR-75-1 (2.7±0.46)、BT-20 (3.8±0.35)、 MDA-MB-231 (5.23q0.35)以及BT-549(4.0±0.56)具有较高的PD-L1表达,而在MCF-7、SKBr-3、T47D及BT-474细胞株中表达较低。2.为了验证PD-L1蛋白在乳腺癌组织中的表达,我们收集了10对乳腺癌及癌旁的组织。通过Western Blot检验,我们发现10对组织中,乳腺癌中的PD-L1均较癌旁组织表达高。应用ImageJ软件分析计算蛋白条带灰度值,经两样本配对T检验显示乳腺癌组织中PD-L1蛋白表达明显高于癌旁组织(P<0.05)。3.PD-L1在乳腺癌组织中表达阳性率为22.7%,PD-L1表达与乳腺癌患者T分期、N分期、ER受体、PR受体相关(P<0.05)。患者中PD-L1阳性的其T、N分期高,且以ER、PR受体阴性为主。PD-L1阳性的患者生存时间明显缩短(P=0.000)。多因素COX回归分析结果显示PD-L1是影响乳腺癌患者生存及预后的独立因素(P=0.038)。结论1.乳腺癌癌组织检测到PD-L1表达,并且其PD-L1阳性表达率明显高于癌旁组织。2.PD-L1表达与乳腺癌患者T分期、N分期呈正相关,而与PR受体表达呈负相关。3.患者ER受体、PR受体及PD-L1的表达与预后显著相关,PD-L1阳性的患者生存时间明显缩短(P=0.000)。4.PD-L1是影响乳腺癌患者生存预后的独立因素。