论文部分内容阅读
背景高迁移率族蛋白l(HMGB1),是一种重要的炎症介质,可由免疫细胞和一些非免疫细胞主动分泌,或受损及坏死细胞被动释放。HMGB1与许多炎症性疾病的发生发展有着密切的关系,诸如：超敏反应、自身免疫性疾病、感染性疾病等。本实验室已有的研究数据表明,HMGB1在实验性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠心脏组织或血清中表达上调；封闭HMGB1可以改善EAM后期的心肌纤维化。然而,迄今为止,没有数据能够直接表明HMGB1与心肌纤维化的关系。据此,本研究旨在探讨：①上调HMGB1有无可能直接导致EAM的心肌纤维化；②在EAM,心肌成纤维细胞／肌纤维母细胞能否分泌HMGB1,可否作为另一高水平]HMGB1源头；③HMGB1阻断能否有效地防止EAM后期的心肌纤维化。此外,对可能参与自身免疫性心肌炎的免疫失调因素进行了初步探讨,包括Toll样受体(TLR)及Runt相关转录因子3(Runx3)/CpG ODN对细胞增殖的影响,及其与IMGB1分泌或释放的关系；妊娠相关疾病患者血清HMGB1的水平及作用。方法本研究所采用的试验方法包括：流式细胞分析、实时荧光定量PCR试验、Western印迹、酶联免疫吸附试验(ELISA)、细胞培养和增殖试验(MTT)、细胞迁移试验以及组织病理学分析等。1.实验性自身免疫性心肌炎小鼠模型的建立BALB/c小鼠,6-8周龄,由扬州大学实验动物中心购买并在江苏大学实验动物中心饲养。本研究使用的所有动物试验过程,均按实验动物管理使用指南(美国国立卫生研究院出版no.85-23,1996修订)操作。小鼠实验性自身免疫性心肌炎模型的诱导方法简介如下：于0天和7天接种含有100ggMyHC-α(MyHC-α614-629; Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH)的1:1PBS/CFA乳化物。在接种的第54天,诱模小鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后颈椎脱位处死,并取相关检材进行分析。所有实验均获江苏大学研究与教学用动物实验委员会批准。2.流式细胞仪分析研究选用了十五例慢性糖尿病患者、十四例妊娠糖尿病患者和十七例先兆子痫患者,年龄从19岁到41岁不等。经免疫荧光染色后,应用流式细胞仪分析计数外周血单个核细胞(PBMC)中Thl7细胞的比率。3.荧光定量]PCR (qRT-PCR)应用RT-qPCR方法,分别检钡TLR2、TLR4、TLR9、RAGE、HMGB1、Ⅰ/Ⅲ胶原(Col1/3)、骨桥蛋白(OPN)、Hlx、Runx3、MMP1和TIMP1/2的mRNA表达水平。4.免疫印迹Western blot检测心肌成纤维细胞/肌纤维母细胞中胶原I、胶原]Ⅲ、P-PKC-β、p-EIK-1/2、f-erk-1/2和HMGB1的蛋白表达水平；同法检测有或无CpG ODN诱导的A549细胞中Runx3的蛋白表达水平。5. ELISA酶联免疫吸附试验(ELISA)用于定量检测慢性糖尿病患者、妊娠糖尿病和先兆子痫患者血浆中的干扰素γ、IL-17、IL-1β和高迁移率族蛋白l(HMGB1)的水平。6.细胞培养与增殖试验根据参考文献[31,32],取1-2周龄BALB/c小鼠,分离心脏成纤维细胞。细胞培养液DMEM(含10%胎牛血清)被用于培养心肌成纤维细胞。用MTT法检测心肌成纤维细胞、肌成纤维细胞的增殖。同时,MTT法也用于分析CpG ODN对Runx3基因特异性siRNA转染的细胞生长的影响。7.迁移试验迁移试验选用6孑LTranswell板与8-1m-pore-size聚碳酸酯过滤器。在有或无外源性HMGB1存在的条件下,分析心脏成纤维细胞和肌成纤维细胞的迁移作用。8.组织病理学分析HE染色方法用于观察实验性自身免疫性心肌炎模型的组织病理学改变；用Sirius red染色法检测心肌纤维化；免疫荧光染色分析在脂多糖刺激下,心肌成纤维细胞、肌成纤维细胞分泌HMGB1的能力。9.统计分析所有数据均显示为平均值士标准差(SD)。Student’s test或双向方差分析用于评价组间差异的显著性。统计学分析采用GraphPad Prism 5和／或SPSS11.5软件,P值<0.05被认为有意义。结果我们的研究结果表明：1.HMGB1可能直接导致心肌胶原沉积,这与PKCβ/ERK1/2信号转导通路相关；此外,在外部应力下,心肌成纤维细胞／肌纤维母细胞主动分泌HMGB1;心脏成纤维细胞／肌纤维母细胞分泌的HMGB1,可通过PKCβ激活以自分泌方式导致心肌纤维化。在EAM小鼠,阻断HMGB1能有效地改善心脏的纤维化。2.在外部压力下,HMGB1可从心脏成纤维细胞和肌成纤维细胞的细胞核穿梭至胞质。本研究还表明,除免疫细胞、内皮细胞、心肌细胞和坏死细胞外,同样作为心脏重要组成的心脏成纤维细胞/肌纤维母细胞,是否在EAM时也充当HMGB1的重要来源。3.在妊娠相关疾病,升高的血浆HMGB1水平很有可能导致ILC的分化和随后生产的IL-17。此外,在包括先兆子痫和妊娠糖尿病在内的妊娠相关性疾病中,增高的IL-17表达水平可能产生于ILC3,并在失控性炎症应答时构成胎儿流产的威胁。4. CpG ODN可显著抑制A549细胞的增殖。在CpG ODN刺激A549细胞,Runx3的表达在mRNA和蛋白水平均增多。CpG ODN对A549细胞增殖的抑制能力,在]Runx3基因siRNA转染后受到明显地控制。这一结果表明,TLR9活化和Runx3基因表达之间存在着密切的关系,也可能与HMGB1分泌有关,需要进一步证实。结论本研究表明,HMGB1可通过PKCβ/ERK1/2-依赖的信号通路直接导致心肌胶原沉积；在外界应力下,心肌成纤维细胞/肌纤维母细胞分泌的HMGB1,通过激活PKCβ以自分泌的方式导致心脏的纤维化；封闭HMGB1都能有效地改善EAM小鼠的心肌纤维化。此外,在妊娠相关疾病的血浆中,HMGB1增高并可导致ILC的分化和随后产生IL-17、TLR9活化与RUNX3基因表达,参与某些细胞的生长调控,并推测可能与IMGB1的分泌相关。